Récupération parallèle de l'accessibilité de la chromatine et de la dynamique de l'expression génique à partir de lymphocytes T régulateurs humains congelés

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 5506 (2023) Citer cet article

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Les caractéristiques épigénétiques telles que l'accessibilité de l'ADN dictent la régulation transcriptionnelle d'une manière spécifique au type et à l'état cellulaire, et la cartographie de la santé par rapport à la maladie dans du matériel cliniquement pertinent ouvre la porte à de nouvelles connaissances mécanistes et à de nouvelles cibles thérapeutiques. Le test de séquençage de la chromatine accessible à la transposase (ATAC-seq) permet le profilage de l'accessibilité de la chromatine à partir d'un faible apport cellulaire, ce qui le rend traitable sur des populations de cellules rares, telles que les cellules T régulatrices (Treg). Cependant, on sait peu de choses sur la compatibilité du test avec les populations de cellules rares cryoconservées. Ici, nous démontrons la robustesse d'un protocole ATAC-seq comparant les cellules Treg primaires récupérées à partir d'échantillons de PBMC frais ou cryoconservés, à l'état d'équilibre et en réponse à la stimulation. Nous étendons cette méthode pour explorer la faisabilité d'effectuer une quantification simultanée de l'accessibilité de la chromatine et du transcriptome à partir d'un seul aliquot de 50 000 cellules Treg cryoconservées. Le profilage de l'accessibilité de la chromatine et de l'expression génique en parallèle dans le même pool de cellules contrôle l'hétérogénéité cellulaire et est particulièrement bénéfique lorsqu'il est limité par un matériel d'entrée limité. Dans l'ensemble, nous avons observé une forte corrélation des modèles d'accessibilité et de la dynamique des facteurs de transcription entre les échantillons frais et cryoconservés. De plus, des profils transcriptomiques très similaires ont été obtenus à partir de cellules entières et à partir des surnageants récupérés des réactions ATAC-seq. Nous soulignons la faisabilité de l'application de ces techniques pour profiler le paysage épigénomique des cellules récupérées à partir de biodépôts de cryoconservation.

L'expression des gènes est régulée par la liaison des facteurs de transcription (TF) aux promoteurs proximaux et aux éléments régulateurs distaux tels que les activateurs. La structure de la chromatine a une influence majeure sur l'expression des gènes en contrôlant l'accès des TF aux sites de liaison dans ces activateurs et promoteurs1. Des schémas localisés de modification épigénétique de la chromatine, tels que la modification des histones, la méthylation de l'ADN et le remodelage des nucléosomes, sont en corrélation avec l'activité activatrice, la liaison du TF et la régulation de la transcription. L'accessibilité de la chromatine concerne le degré auquel les protéines sont capables d'interagir physiquement avec la chromatine et est fortement influencée par les modifications épigénétiques, le positionnement des nucléosomes et les protéines de liaison à la chromatine qui restreignent l'accès à l'ADN2. Une chromatine plus accessible ou ouverte est associée à des régions actives transcriptionnelles et à des éléments régulateurs, tandis que la chromatine fermée est associée à des régions silencieuses ou réprimées. Par exemple, bien que l'ADN accessible représente environ 2 à 3 % du génome, il capture plus de 90 % des régions occupées par les TF analysés dans le projet ENCODE2,3,4. L'accessibilité de la chromatine est généralement déterminée expérimentalement par la sensibilité de la chromatine à la méthylation ou au clivage enzymatique. Cependant, les méthodes conventionnelles de profilage de la chromatine telles que DNase-seq nécessitent des millions de cellules comme exigence d'entrée et impliquent un flux de travail complexe de préparation de bibliothèque. Le dosage de la chromatine accessible à la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) est une approche relativement nouvelle à l'échelle du génome qui sonde simultanément la structure de la chromatine (accessibilité et positionnement du nucléosome) et, surtout, la liaison du TF à haute résolution avec une exigence d'entrée inférieure à celle des autres techniques5,6 . Le développement d'ATAC-seq a permis de quantifier l'accessibilité de la chromatine en utilisant un nombre beaucoup plus faible de cellules, ce qui la rend accessible au contexte clinique et aux populations de cellules rares d'intérêt. La mesure de l'accessibilité de la chromatine à une résolution de cellule unique est également devenue possible avec le développement de stratégies de séquençage ATAC unicellulaire (scATAC-seq)7,8,9. Dans ATAC-seq, la transposase Tn5, préchargée avec des adaptateurs de séquençage de nouvelle génération, coupe et ligature simultanément les adaptateurs de séquençage dans les régions de chromatine ouvertes accessibles5,6. Les fragments capturés entre les adaptateurs peuvent ensuite être amplifiés par PCR et soumis à un séquençage à haut débit5,6.

Les mécanismes épigénétiques régissent un aspect important de la machinerie d'expression génique essentielle au développement et à la différenciation des cellules10,11. Des perturbations épigénétiques et une expression génique altérée ont été rapportées dans de nombreuses maladies auto-immunes telles que le lupus érythémateux disséminé (LES), les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), la polyarthrite rhumatoïde (PR) et la sclérose en plaques (SEP)12. Le profilage de l'accessibilité de la chromatine dans les cohortes de maladies augmentera notre compréhension de la dérégulation de l'épigénétique dans l'auto-immunité et contribuera grandement au développement de la recherche translationnelle et de la médecine personnalisée grâce à l'identification de signatures épigénétiques pertinentes pour la maladie. Bien que le protocole soit largement appliqué sur des échantillons fraîchement traités, seul un certain nombre d'études ont examiné l'effet de la cryoconservation sur la structure de la chromatine et l'expression des gènes13,14,15,16,17,18,19, aucune à ce jour n'a été réalisée sur des T humains primaires. sous-ensembles de cellules, y compris les cellules T (Treg) FOXP3+ humaines cryoconservées. Les cellules T régulatrices FOXP3+ (Treg) sont un sous-ensemble rare de lymphocytes qui maintiennent la tolérance immunitaire et préviennent les réponses immunitaires inappropriées20,21,22,23. Des altérations de la fréquence et de la fonction des cellules Treg ont été impliquées dans un large éventail de maladies auto-immunes, notamment le diabète de type 1 (DT1)24, SLE25, IBD26 et RA27.

La cryoconservation de cellules et de tissus vivants intacts est une pratique courante dans les applications de recherche fondamentale et clinique, permettant le suivi de patients ou d'échantillons à travers les états de symptômes et au fil du temps. La cryoconservation devient essentielle dans les grandes études de cohorte où un grand nombre d'échantillons ou de nombreux traitements ou moments empêchent la génomique sur des échantillons frais. Ces biodépôts apportent de plus en plus une contribution significative à l'amélioration de notre compréhension, du diagnostic, de la prévention et de la guérison de maladies complexes28,29. Des améliorations significatives dans la collecte et le stockage d'échantillons biologiques humains ont été observées au cours des dernières décennies29, permettant l'identification de biomarqueurs de maladies pour éclairer le diagnostic et le pronostic, ainsi que le développement de médicaments. Les biobanques sont de plus en plus utilisées dans de nombreux domaines, y compris l'auto-immunité. En appliquant ces approches génomiques de pointe au matériel biobanqué, il est donc impératif de s'assurer que les cellules récupérées récapitulent étroitement le phénotype des cellules fraîches pour une interprétation et une traduction clinique précises, cependant, des rapports sondent les effets de la cryoconservation sur l'épigénétique des cellules récupérées les cellules sont limitées13,14.

Pour que des analyses multi-omiques de haute qualité soient effectuées sur ces biobanques, non seulement la viabilité et la récupération post-dégel sont une mesure importante, mais les échantillons récupérés doivent refléter étroitement l'état physiologique et biochimique de leur état de pré-congélation. Pour tester cela, nous avons adopté les normes de biobanque établies par l'étude ENDIA (Environmental Determinants of Islet Autoimmunity)30,31 pour la cryoconservation des PBMC obtenus à partir de sujets humains adultes en bonne santé. Notre étude a pour objectif d'évaluer le paysage mondial de l'accessibilité à la chromatine des populations de cellules immunitaires rares cryoconservées, et a testé la faisabilité de quantifier l'accessibilité de la chromatine et le transcriptome en parallèle à partir d'une seule réaction de 50 000 cellules. Plus précisément, nous avons demandé si la congélation avant l'isolement des noyaux compromettait l'intégrité nucléaire et altérait la structure de la chromatine dans les cellules FOXP3+ Regulatory T (Treg).

Comme les cellules immunitaires doivent répondre aux stimuli environnementaux, elles ont des programmes de transcription hautement coordonnés qui pilotent l'induction de gènes de réponse immunitaire dotés de fonctions spécialisées pour une réponse immunitaire appropriée contre les agents pathogènes envahisseurs et le cancer. La dérégulation de ces programmes transcriptionnels est en revanche associée à l'auto-immunité. La sensibilité et la réactivité des cellules aux stimuli externes dictent de manière critique l'ampleur de l'accessibilité de la chromatine et des changements d'expression génique, et leur perturbation peut être le moteur de la maladie. Pour appliquer cela dans un contexte de cellules immunitaires, nous avons adopté Omni ATAC-seq32 car il a été démontré qu'il apportait une amélioration substantielle de la qualité des données dans de multiples applications, y compris les matériaux congelés. L'ATAC-seq a été réalisée sur des cellules Treg isolées à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) obtenues à partir de sujets humains adultes en bonne santé, traitées fraîches ou stockées cryogéniquement et décongelées conformément aux protocoles de biobanque publiés31. Nous avons profilé l'accessibilité de la chromatine et l'occupation du TF dans les cellules Treg à l'état d'équilibre et en réponse à la stimulation. Nous avons démontré que l'isolement de noyaux intacts à partir d'échantillons fraîchement traités et décongelés produisait des schémas d'accessibilité de la chromatine pratiquement impossibles à distinguer entre les groupes. En outre, nous décrivons un flux de travail qui intègre ATAC-seq et ARN-seq pour mesurer l'accessibilité de la chromatine et l'expression des gènes simultanément dans 50 000 cellules, permettant l'inférence de l'association réglementaire entre les deux systèmes à partir du même pool de cellules. Dans le flux de travail ATAC-seq, après une lyse cellulaire douce, les fractions nucléaires et cytoplasmiques sont séparées par centrifugation. Le noyau est soumis à ATAC-seq tandis que la fraction surnageante contenant la fraction cytoplasmique est soumise à RNA-seq. Nous avons observé une concordance élevée dans le profil transcriptomique entre l'ARN purifié à partir de cellules entières et les fractions de surnageant ATAC-seq d'échantillons cryoconservés, indiquant que le profilage parallèle de l'accessibilité de la chromatine et de l'expression génique est une approche valide dans les expériences contraintes par le matériel d'entrée. En résumé, nous démontrons qu'une analyse combinée ATAC-seq et ARN-seq peut être appliquée à des cellules biobanquées regroupées, et les résultats montrent une forte corrélation avec les mêmes tests effectués sur des cellules fraîchement isolées, qu'elles soient au repos ou activées. Cela donne confiance lors de l'application de ces approches aux cellules immunitaires biobanquées provenant de cohortes cliniques.

Pour tester si le matériel congelé de la biobanque reflète fidèlement le matériel frais, chaque échantillon de PBMC obtenu à partir d'un sujet adulte humain en bonne santé a été divisé en deux, un a été traité immédiatement et l'autre moitié cryoconservée et stockée avant décongélation pour l'isolement cellulaire et l'ATAC-seq et l'ARN- expériences suivantes. Le stockage cryogénique n'a pas affecté de manière significative la viabilité cellulaire, la récupération ou la fréquence des cellules CD4 + Tconv et Treg (Fig. 1a – d). De plus, le processus de congélation a préservé la complexité des lymphocytes T, comme le démontre l'analyse par cytométrie en flux (Fig. 1d) ainsi que la préservation des sous-ensembles de lymphocytes T identifiés par l'analyse de l'incorporation de voisins stochastiques distribués en t (t-SNE) (Fig. 1e, f et Fig. 1 supplémentaire). Des grappes de population de cellules bien formées ont été identifiées dans les cellules T CD4 + fraîches et décongelées (Fig. 1c) et elles incluent des populations exprimant des signatures de cellules T telles que FOXP3, CD25, CD127, CD45RA et CCR10 (Fig. 1 supplémentaire). Toutes ces données démontrent que les lymphocytes T isolés à partir de matériel décongelé sont des marqueurs de surface cellulaire viables et présentent des marqueurs similaires à ceux des cellules fraîchement traitées.

La complexité des échantillons congelés récapitule celle des échantillons frais. Viabilité (a) et numération cellulaire absolue (b) des échantillons de PBMC frais et décongelés. ( c ) Récupération (%) de la récupération des PBMC vivants après décongélation. La viabilité cellulaire et la récupération des échantillons de PBMC ont été déterminées en utilisant le test d'exclusion du colorant bleu trypan. ( d ) Profil cytométrique en flux à partir d'un échantillon représentatif de PBMC frais et décongelés et stratégie de déclenchement pour isoler les cellules T conventionnelles (Tconv) et T réglementaires (Treg). ( e - f ) Diagrammes de points de couleur montrant des événements provenant de cellules positives CD4 fraîches ( e ) et décongelées ( f ) contribuant à la distribution t-SNE (incorporation de voisins stochastiques distribués en t) avec regroupement manuel.

Pour demander si le processus de cryoconservation modifie le paysage d'accessibilité de la chromatine des cellules T régulatrices (Treg), nous avons effectué Omni ATAC-seq sur des cellules CD4 + CD25hi CD127lo Treg de PBMC obtenues à partir de sujets humains adultes en bonne santé. Les échantillons de PBMC ont été divisés et soit traités immédiatement, soit stockés cryogéniquement avant l'isolement de CD4 + Treg (Fig. 2 supplémentaire). Nous avons adopté Omni ATAC-seq car il était connu pour offrir une qualité de cartographie de lecture élevée et une complexité de bibliothèque33 et nous l'avons confirmé avec notre propre analyse de l'identification des pics sur les ensembles de données modèles (Fig. 11 supplémentaire). Pour sonder davantage la réactivité des Treg récupérés, les cellules Treg isolées ont été soit laissées non traitées (au repos), soit stimulées à l'aide de Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28 pendant 48 h avant Omni ATAC-seq (tableau supplémentaire 1 pour la sortie de séquençage). Nous avons identifié une moyenne de 41 587 pics reproductibles pour les échantillons frais (au repos), 45 534 pics reproductibles pour les échantillons décongelés (au repos), 88 631 pics reproductibles pour les échantillons frais (stimulés) et 95 670 pics reproductibles pour les échantillons décongelés (stimulés) (Fig. 5a supplémentaire). . Il n'y avait pas de différence significative dans le nombre de pics reproductibles entre les paires de donneurs dans les groupes frais et cryoconservés (Fig. 5b supplémentaire). La distribution de la taille des fragments des bibliothèques ATAC-seq amplifiées générées à partir de cellules Treg fraîches et décongelées a montré un schéma d'échelle nucléosomique clair et caractéristique avec une périodicité de 200 pb, correspondant à des fragments d'ADN provenant de régions sans nucléosome (NFR) ou de régions protégées par un nombre entier multiples de nucléosomes en phase (Fig. 2a, Fig. 3 et 4 supplémentaires), indicatifs de bibliothèques ATAC-seq de qualité. Les cellules Treg décongelées présentent un signal ATAC-seq structuré similaire autour des nucléosomes que les échantillons frais (Fig. 4 supplémentaire) avec des profils Treg ATAC-seq frais et décongelés montrant un motif distinctif en forme de V où l'apex représente le fragment le plus court possible qui est protégé par un nucléosome (~ 117 pb). La position la plus enrichie dans le V-plot correspond à des fragments de 143 pb centrés sur la dyade de nucléosomes, qui est la longueur d'ADN lié par un nucléosome canonique. Ce modèle d'organisation de l'architecture de la chromatine est en accord avec ceux obtenus par Schep et al.34. Un schéma de périodicité nucléosomique plus frappant a été observé lors de la stimulation dans les cellules Treg fraîches et décongelées par rapport à leurs homologues au repos (Fig. 4 supplémentaire). Cela suggère que la stimulation entraîne des altérations significatives du remodelage des nucléosomes et de l'accessibilité de la chromatine. Ces résultats confirment que la congélation n'a pas perturbé le déplacement et la mise en phase des nucléosomes le long de la séquence d'ADN.

La qualité de l'ATAC-seq des cellules Treg décongelées récapitule étroitement celle des cellules fraîches. ( a ) La distribution de la taille des inserts des bibliothèques Treg ATAC-seq fraîches et décongelées. ( b ) Complexité complète de la bibliothèque et courbe de rendement extrapolée des bibliothèques ATAC-seq fraîches et décongelées. Les mesures de complexité sont tracées par rapport à la complexité la plus élevée (100 % de lectures mappées de manière unique). ( c ) Distribution du signal ATAC-seq à ± 1, 5 kb sites de début de transcription (TSS). La couverture du signal est calculée à partir des lectures par million de lectures mappées pour chaque échantillon. ( d ) Pourcentage de lectures cartographiées sur le génome mitochondrial. Une couleur plus profonde est utilisée pour représenter la valeur la plus souhaitable de la statistique et de la plage suivant une échelle linéaire commençant à 0 (noir) et se terminant à la valeur maximale (jaune). Toutes les valeurs ont été déterminées à partir de la profondeur totale des lectures alignées. La signification statistique de la différence entre les échantillons frais et décongelés est calculée par le test t de Student apparié. Les données présentées en ac sont représentatives des lectures de séquençage regroupées à partir de trois donneurs.

Les bibliothèques fraîches et décongelées ont démontré une complexité moléculaire comparable (Fig. 2b) et un enrichissement des sites de début de transcription (TSS) (Fig. 2c), une mesure clé du rapport signal sur bruit tel que recommandé par ENCODE4, dans les états de repos et stimulés. . Aucune différence significative n'a été observée dans la proportion de lectures mitochondriales entre les bibliothèques ATAC-seq générées à partir des cellules Treg fraîches et décongelées (Fig. 2d). Nous n'avons également observé aucune différence significative dans la fraction de lectures cartographiées dans les régions de pointe ATAC-seq (FRiP) (Fig. 3a) ou leur distribution génomique (Fig. 3b) dans les échantillons fraîchement traités par rapport aux échantillons congelés, ce qui suggère que la cryoconservation n'a pas modifié le efficacité de transposition dans les régions de chromatine accessibles. Une augmentation équivalente du nombre de lectures par pic après la stimulation cellulaire indiquait que la cryoconservation n'affectait pas de manière importante les modifications de l'organisation de la chromatine lors de l'activation cellulaire (Fig. 3a et Fig. 5a supplémentaire). De plus, les échantillons frais et décongelés ont montré une forte corrélation des signaux de pointe indiquant que le gel-dégel n'avait pas d'impact appréciable sur le paysage de la chromatine accessible dans les cellules au repos ou stimulées (Fig. 3c – e, Fig. 6 supplémentaire). Le paysage d'accessibilité de la chromatine aux locus indispensables à la fonction et au développement des Treg, tels que IL2RA (Interleukin 2 Receptor Subunit Alpha) et FOXP3 (Forkhead box P3), s'est également avéré hautement préservé (Fig. 3f, g). Ensemble, ces observations suggèrent que la cryoconservation ne perturbe pas les réponses cellulaires, le paysage de la chromatine et les signatures épigénétiques et que le protocole peut être appliqué sur des cellules Treg humaines primaires cryoconservées.

L'accessibilité de la chromatine est maintenue grâce à la cryoconservation. ( a ) La fraction de lectures dans les pics pour les bibliothèques Treg ATAC-seq fraîches et décongelées. La signification statistique de la différence entre les échantillons frais et décongelés est calculée par le test t de Student apparié. ( b ) Distribution des pics ATAC-seq sur des caractéristiques génomiques distinctes exprimées en proportion des pics annotés. Les promoteurs sont définis par la région TSS de -1 kb à + 100 bp. Autre, pics annotés en 3'UTR, 5'UTR, miARN, ARN non codant et TTS (site de terminaison de la transcription). ( c, d ) Nuage de points du nombre de lectures par million (CPM) de lectures dans les pics ATAC-seq identifiés à partir d'échantillons frais et décongelés pendant le repos ( c ) et en réponse à la stimulation ( d ). La valeur du coefficient de corrélation de Pearson est indiquée. ( e ) Corrélogramme montrant l'association des lectures CPM pour tous les échantillons ATAC-seq générés pour cette étude. (f, g) Profils d'accessibilité de la chromatine des cellules Treg fraîches et décongelées au repos et à l'état stimulé aux locus IL2RA (f) et FOXP3 (g). Le signal ATAC-seq est croisé avec les super activateurs des lymphocytes T, les états de la chromatine Treg du projet Roadmap Epigenomics et les sites de liaison FOXP3. Chaque piste ATAC-seq représente le signal regroupé à partir de trois donneurs. La vue du navigateur a été générée à l'aide du navigateur du génome UCSC. Le calcul pour ag a été effectué sur des données regroupées représentatives de trois donneurs.

Les cellules immunitaires répondent constamment aux stimuli environnementaux en reprogrammant les domaines de la chromatine, ce qui entraîne des programmes de transcription qui entraînent l'induction de gènes de réponse immunitaire dotés de fonctions spécialisées. Les régions génomiques spécifiques à la stimulation des lymphocytes T sont enrichies pour les GWAS-eQTL ou les SNP associés à des maladies auto-immunes telles que les MII et la PR, ainsi que pour les activateurs spécifiques du sous-ensemble de lymphocytes T, soulignant l'importance du profilage des cellules immunitaires sous stimulation pour identifier les régulateurs pertinents pour la maladie. éléments et mécanismes35,36. Conformément à des études antérieures35,36, la stimulation entraîne une augmentation globale des modifications de la chromatine. Une concordance élevée des changements d'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome et de l'occupation du TF a été observée dans les cellules Treg fraîches et décongelées en réponse à la stimulation (Fig. 4a, Fig. 7 supplémentaire et Tableau supplémentaire 2), y compris au niveau des gènes de signature Treg classiques37. Nous avons étendu cette analyse pour évaluer la corrélation entre le signal d'accessibilité du promoteur et l'expression génique correspondante générée à partir de cellules Treg décongelées à l'aide d'ARN-seq de cellules entières, car le consensus général est qu'un promoteur accessible est indicatif de l'expression génique active. En accord avec d'autres études38,39, la corrélation entre l'accessibilité du promoteur et l'expression génique respective était significative (Fig. 5a et Tableau supplémentaire 2), ce qui suggère que la congélation n'a pas altéré l'induction de l'épigénome sensible à l'activation et de l'expression génique dans les cellules Treg.

Les cellules Treg décongelées démontrent une activité TF comparable aux cellules fraîches. ATAC-seq a été réalisé sur des cellules Treg triées au repos et stimulées fraîches et décongelées. ( a ) Corrélation des changements d'accessibilité de la chromatine sensibles à la stimulation dans les cellules Treg fraîches et décongelées (exprimées en changements de pli dans les lectures dans les pics entre les états de repos et stimulés). Des locus génomiques différentiellement accessibles entre les états de repos et stimulés ont été définis comme des gènes ayant un FDR inférieur à 0,05 et un changement logarithmique significativement supérieur (rouge) ou inférieur (bleu) à 1,2 (équivalent à une différence de 2,3 fois entre les conditions) . Les pics ATAC-seq ont été annotés au TSS le plus proche et les pics communs accessibles de manière différentielle avec un changement de pli logarithmique significativement supérieur/inférieur à 4 sont annotés par le symbole du gène. Les 20 principaux gènes de signature Treg accessibles de manière différentielle (Ferraro et al. 37) sont surlignés en vert. ( b – d ) Histogramme comparant des fragments d'échantillons frais et décongelés aux motifs de liaison FOXP3 ( b ), CTCF , RUNX1 , CREB1 , GATA3 , IRF1 et YY1 pendant les états de repos ( c ) et stimulés ( d ). Le signal d'occupation TF est calculé sur les empreintes ATAC-seq à l'échelle du génome correspondant aux motifs correspondants obtenus à partir de la base de données JASPAR. Des histogrammes sont générés à partir de signaux d'accessibilité de la chromatine Treg calculés à partir de données de séquençage regroupées représentatives de trois donneurs.

Mesure parallèle de l'accessibilité de la chromatine et de la dynamique du transcriptome dans les cellules Treg humaines. L'ARN-seq a été réalisé à l'aide d'ARN isolé à partir de cellules entières ou d'une fraction surnageante (cytoplasmique) récupérée à partir de la réaction ATAC-seq préparée à partir de cellules Treg décongelées. ( a ) Corrélation de l'accessibilité de la chromatine sensible à la stimulation et des modifications de l'expression génique dans les cellules Treg entières décongelées (exprimées sous forme de changements de pli entre les états de repos et stimulés). Les gènes promoteurs / exprimés différentiellement accessibles entre les états de repos et stimulés ont été définis comme des gènes ayant un FDR inférieur à 0, 05 et un changement de facteur logarithmique significativement supérieur ou inférieur à 1, 5. Les promoteurs ayant une accessibilité différentielle de la chromatine et des changements d'expression lors de la stimulation sont mis en évidence. La ligne bleue indique un loess fit à la distribution. ( b ) Analyse différentielle des profils transcriptomiques générés à partir de la fraction surnageante ATAC-seq (cytoplasmique) et des cellules Treg entières. Les gènes exprimés de manière différentielle ont été définis comme des gènes ayant un FDR inférieur à 0,05 et un changement de facteur logarithmique significativement supérieur (rouge) ou inférieur (bleu) à 1,5. Les 20 principaux gènes différentiellement accessibles sont annotés par des symboles de gènes. ( c ) Corrélation des profils transcriptomiques générés à partir de la fraction de surnageant ATAC-seq et des cellules entières. L'expression de chaque gène est représentée par le nombre de logs par million (CPM) de lectures de séquençage. Les gènes différentiellement exprimés sont surlignés en rouge. Les résultats présentés sont représentatifs de quatre donneurs.

Dans la chromatine accessible, les séquences d'ADN liées au facteur de transcription (TF) sont sélectivement résistantes au clivage Tn5, ce qui se traduit par de courtes régions d'ADN ou d'empreintes protégées. L'analyse de l'empreinte d'Omni ATAC-seq a été réalisée avec des fragments accessibles regroupés représentant des régions sans nucléosome (NFR) et des régions liées par un nucléosome (1N)40. Un total de 551 empreintes TF ont été découvertes dans nos données Treg ATAC-seq (tableau supplémentaire 3). Nous avons observé des empreintes de TF claires et discrètes dans les régions accessibles identifiées à partir de nos cellules Treg fraîches et décongelées pendant l'état de repos et en réponse à la stimulation (Fig. 4b – d). La superposition du signal d'empreinte à l'échelle du génome associé à des échantillons de Treg frais et décongelés a indiqué que des niveaux d'accessibilité similaires ont été observés autour des positions des sites de liaison TF prédits pour une large gamme de TF, y compris FOXP3, qui est le maître TF des cellules Treg (Fig. 4b ), ainsi que TF avec des rôles importants dans les cellules T telles que CTCF, RUNX1, CREB1, GATA3, IRF1 et YY1 (Fig. 4c, d). Ces données indiquent fortement un paysage de chromatine et une occupation de TF indiscernables dans les régions de chromatine ouvertes dans des cellules Treg fraîches et décongelées, et la congélation ou la biobanque n'a pas affecté la capacité à résoudre les modèles d'accessibilité de l'occupation de TF à paire de bases unique et n'a eu aucun effet global sur TF -Interactions ADN.

Le profilage parallèle de l'accessibilité de la chromatine et du transcriptome au sein du même pool de cellules permet de démêler la relation complexe entre les éléments régulateurs et les programmes d'expression génique. Cette approche sera complémentaire aux expériences unicellulaires, car les bibliothèques utilisées pour profiler l'accessibilité de la chromatine et le transcriptome sont dérivées de la même population de cellules, contrôlant la fluctuation stochastique des gènes dans différentes cellules d'une population à un moment donné. Ce flux de travail est particulièrement bénéfique pour les expériences limitées par un matériel d'entrée limité tel que l'utilisation d'une population de cellules humaines rares et cryoconservées. Dans le flux de travail ATAC-seq, les lysats de cellules entières sont séparés en fractions nucléaires et cytoplasmiques par centrifugation. Nous avons soumis le noyau à ATAC-seq, tandis que l'ARN a été isolé du composant surnageant et soumis à ARN-seq. Lors de l'évaluation de la faisabilité de l'utilisation de l'ARN récupéré à partir du surnageant ATAC-seq dérivé du cytoplasme (ATAC-SN), nous avons d'abord évalué les modèles d'expression génique globale de l'ATAC-SN par rapport à l'ARN total isolé à partir de cellules Treg humaines intactes. L'ATAC-SN et la fraction de cellules entières présentaient une corrélation significativement élevée (R = 0,94 ; valeur p < 2,2 × 10–16) de l'abondance des transcrits, où 90,7 % (10 472 gènes sur 11 548) du transcriptome n'étaient pas significativement modifiés dans les deux compartiments (Fig. 5b, c et tableau supplémentaire 2). Le critère de signification a été défini comme un taux de fausses découvertes (FDR) inférieur à 0,05. Ceux-ci confirment qu'il y a un biais minimal introduit par la méthode.

Une petite fraction (9,4%) des gènes ont été différentiellement enrichis dans l'ATAC-SN dérivé du cytoplasme par rapport aux compartiments cellulaires entiers. La majorité des gènes responsables des différences dans les niveaux d'expression étaient des gènes régulés négativement dans la fraction ATAC-SN. Des analyses d'enrichissement d'ontologie génique (GO) ont été effectuées pour les gènes qui étaient significativement plus abondants ou appauvris dans la fraction ATAC-SN. Les transcriptions sous-représentées dans l'ATAC-SN étaient associées à des processus biologiques nucléaires et à des fonctions moléculaires, notamment la division nucléaire, la modification des histones, la division nucléaire, l'organisation des chromosomes et la glycoprotéine (Fig. 8a, c supplémentaires). De plus, nos résultats ont également montré que les gènes détectés à des niveaux inférieurs dans l'ATAC-SN par rapport à la fraction cellulaire entière étaient associés à une stabilité réduite de l'ARN dans les lignées cellulaires lymphoblastoïdes humaines HapMap (LCL), 41 (Fig. 9 supplémentaire) . En revanche, les transcrits enrichis en fraction ATAC-SN étaient impliqués dans des processus associés à la membrane tels que le ciblage protéique co-traductionnel vers la membrane, le ciblage protéique vers le réticulum endoplasmique (RE), ainsi que la traduction cytoplasmique, l'organisation des mitochondries et le ribosome. biogenèse (Fig. 8b, d supplémentaires). Ces résultats montrent un chevauchement élevé avec des études dans d'autres tissus qui ont identifié un enrichissement différentiel des molécules d'ARNm dans les compartiments nucléaire et cytoplasmique42,43,44. Par exemple, il a été démontré dans Zaghlool et al.44 que de nombreux ARNm de protéines mitochondriales codées par le noyau (NEMP) sont considérablement enrichis dans le compartiment cytosolique dans divers types de tissus humains. Pour déterminer si les ARNm des NEMP étaient également préférentiellement localisés dans la fraction ATAC-SN des lymphocytes T humains, nous avons récupéré une liste complète de gènes (n = 1158) codant pour des protéines associées à la localisation mitochondriale de Mitocharta2.045 et effectué une analyse d'enrichissement génique pour l'expression différentielle gènes régulés à la hausse ou à la baisse dans la fraction ATAC-SN et les NEMP humaines. En accord avec l'étude précédente, nous avons observé une abondance de transcrits de NEMP dans le compartiment cytosolique. Nos résultats montrent qu'un total de 71 (20,6%) gènes significativement régulés à la hausse dans l'ATAC-SN dérivé du cytoplasme chevauchaient l'ensemble de données des NEMP humains, alors que seuls 13 (1,6%) gènes régulés à la baisse dans l'ATAC-SN étaient des NEMP (Fig. 10a). Il a été démontré que les NEMP étaient significativement enrichis uniquement dans la fraction ATAC-SN (valeur p = 6 × 10–10) et non dans les extraits cellulaires entiers (Fig. 10b supplémentaire), ce qui correspond au fait que la fraction ATAC-SN est principalement dérivée de cytosolique . Dans l'ensemble, nous concluons que les transcriptomes dérivés de l'ATAC-SN et des cellules entières présentaient un degré élevé de concordance (> 90%) et que l'ATAC-SN peut être utilisé pour étudier les modèles globaux d'expression génique à partir de faibles ressources d'entrée telles que les populations de cellules rares. ou des échantillons cliniques. Nos résultats indiquent également que l'ATAC-SN préserve la localisation subcellulaire de l'ARNm enrichi cytoplasmique, comme le confirme l'enrichissement des NEMP.

Bien qu'il ait été postulé que la cryoconservation peut avoir un impact sur la viabilité et la fonctionnalité des PBMC46,47, et que les cycles de congélation-décongélation répétés ont un impact négatif sur la viabilité et la fonction cellulaire48, l'utilisation d'échantillons frais provenant de grandes cohortes ou d'études longitudinales pose plusieurs problèmes d'effet de lot , et les biobanques les atténuent. Le potentiel d'introduction de variables de confusion dans les analyses en aval est plus élevé pour les échantillons frais traités sur une durée prolongée par rapport aux échantillons cryoconservés par lots. De plus, la seule dépendance à l'égard d'échantillons frais empêche l'accès par de futures recherches pour des études de validation. ATAC-seq est largement appliqué sur des échantillons fraîchement traités et seul un nombre limité d'études ont été réalisées pour évaluer les effets de la cryoconservation sur la structure de la chromatine13,14. Dans cette étude, nous avons démontré que l'ATAC-seq peut être utilisé de manière fiable pour évaluer le paysage global de l'accessibilité de la chromatine des cellules T régulatrices primaires (Treg) récupérées à partir de sang périphérique humain cryoconservé, et cela se prête probablement à d'autres sous-types de cellules T ou immunitaires. Nous avons d'abord démontré que la cryoconservation n'avait aucun effet significatif sur la viabilité des lymphocytes T ou la complexité de la population. En utilisant les critères recommandés par le consortium ENCODE4, nous avons démontré que les bibliothèques ATAC-seq préparées à partir de cellules décongelées offraient un rapport signal sur bruit élevé, comparable aux bibliothèques préparées à partir de cellules fraîchement traitées. Nous avons en outre observé des données d'accessibilité de la chromatine de haute qualité dans les cellules Treg cryoconservées en ce qui concerne la complexité de la bibliothèque, l'occupation du TF et la réactivité cellulaire à la stimulation, ce qui était très similaire aux résultats obtenus avec des cellules fraîchement isolées. Enfin, les résultats de cette étude montrent que le signal d'accessibilité aux loci des gènes et les empreintes d'occupation du TF essentielles à l'activation et à la fonction des Treg étaient bien conservés dans les cellules récupérées de la cryoconservation, renforçant que le processus n'a pas perturbé les signatures épigénétiques essentielles à la régulation du transcriptome dans Cellules Treg. Ces résultats reflètent ceux de Scharer et al.13 et de Fujiwara et al.14 dans les lymphocytes B primaires et les lignées cellulaires du cancer du sein, qui ont également trouvé une forte corrélation des rapports signal sur bruit, des niveaux d'accessibilité et des modèles d'empreinte TF entre les échantillons frais et biobanqués. Une corrélation élevée entre les cellules fraîches et congelées a également été observée dans les profils ATAC-seq unicellulaires générés à partir d'échantillons de PBMC49.

Alors que des recherches antérieures se sont concentrées sur l'impact de la congélation sur l'architecture de la chromatine à l'échelle du génome dans les cellules à l'état d'équilibre, nos résultats s'appuient sur cela en démontrant une accessibilité de la chromatine et une occupation du TF indiscernables dans les cellules T isolées à partir d'échantillons de PBMC biobanqués à l'état de repos et, critique en réponse à la stimulation cellulaire. Il a été démontré que la stimulation entraîne des changements globaux à grande échelle dans l'accessibilité de la chromatine35,36. La dérégulation de l'homéostasie et de l'activation immunitaires est connue pour jouer un rôle dans le cancer et l'auto-immunité et des centaines de variants génétiques ont été associés à la régulation transcriptionnelle spécifique à la stimulation et à l'expression génique dans les cellules T50,51. Il convient de noter qu'au niveau de l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome, les différences capturées entre les bibliothèques Treg ATAC-seq fraîches et décongelées étaient minimes et des changements plus appréciables ont été détectés lors de la comparaison du repos avec la stimulation dans les échantillons frais et décongelés ( Figures supplémentaires 5 et 6). Il est encourageant que les résultats de cette étude indiquent également que la réactivité à l'activation des échantillons de Treg récupérés à partir de PBMC cryoconservés était presque impossible à distinguer des échantillons frais, confirmant que le processus de biobanque n'a pas compromis la sensibilité des cellules à répondre à l'activation et à la reprogrammation épigénétique de réponses immunitaires. Il est important de noter que l'accessibilité de la chromatine des échantillons cryoconservés était positivement corrélée à l'expression des gènes cibles. Cela fournit des informations précieuses sur les réseaux de régulation, ce qui n'est pas possible avec les seuls profils transcriptomiques. Pris ensemble, cela confirme que les échantillons biobanqués peuvent être utilisés de manière fiable pour identifier les facteurs génétiques ou épigénétiques afin de révéler les mécanismes de la maladie résultant d'un dérèglement immunitaire.

Pour étendre l'applicabilité de la génomique aux échantillons biobanqués à faible nombre de cellules ou aux cellules rares dans le sang, nous avons également développé un flux de travail conçu pour le profilage parallèle de l'accessibilité de la chromatine et du transcriptome au sein de la même population de 50 000 cellules. Ce flux de travail a été conçu pour permettre des expériences limitées par un matériel d'entrée limité, tel que l'utilisation d'échantillons pédiatriques cliniques ou de types de cellules rares. Dans le contexte de la maladie, non seulement le pontage ATAC-seq et RNA-seq nous aide à comprendre comment l'épigénétique est altérée, mais il donne un aperçu des mécanismes moléculaires par lesquels les éléments régulateurs contribuent à la pathologie de la maladie. Dans le protocole ATAC-seq, lors de la lyse cellulaire, la centrifugation sépare le matériel cellulaire lysé en deux fractions : 1) culot, qui contient des noyaux intacts, qui est utilisé pour la transposition de Tn5 dans ATAC-seq, et 2) surnageant, qui contient des lysats dérivés principalement du cytoplasme et des organites non nucléaires. Nous avons établi un protocole pour profiler le transcriptome du surnageant du lysat nucléaire (« ATAC-SN ») et avons révélé une forte corrélation dans la distribution relative des transcrits dérivés de l'ATAC-SN et des extraits cellulaires totaux dans les cellules Treg humaines primaires. Ces résultats confirment que la majorité du transcriptome était congruent dans les deux compartiments, et une forte proportion de gènes ont été détectés en quantités similaires. Bien que l'analyse du transcriptome telle que RNA-seq et microarray ait été principalement réalisée à l'aide d'ARN extrait de cellules entières, des preuves croissantes soulignent l'importance d'étudier le répertoire subcellulaire des molécules d'ARN et de comprendre la dimension spatiale qui régit leur distribution à l'intérieur de la cellule52,53, 54,55. Une majorité de la fraction ATAC-SN comprend de l'ARN cytoplasmique et des études ont démontré que le transcriptome cytoplasmique est fortement corrélé avec le transcriptome cellulaire entier42,56. L'ARN cytoplasmique peut être un meilleur indicateur des niveaux de protéines puisqu'il a été suggéré que la fraction cytoplasmique fournit une représentation plus légitime de l'ARNm à l'état d'équilibre43,57. Trask et al.43 ont décrit que les composants nucléaires doivent être exclus, ou au moins analysés séparément des fractions cytoplasmiques pour une quantification précise et reproductible de l'expression génique. Il a été rapporté que l'inclusion d'ARN nucléaire, qui représente 10 à 15 % de l'ARN42 total, déforme le profil d'ARNm et contribue à un niveau substantiel de faux positifs. Cette étude a fait valoir qu'en omettant un sous-ensemble de transcrits nucléaires à expression variable ou stochastique, des gènes exprimés de manière différentielle qui auraient été manqués ou, statistiquement non significatifs en utilisant les fractions de cellules entières, ont été récupérés.

Dans l'ensemble, nous avons détecté un chevauchement élevé des transcriptomes (90, 7%; R = 0, 94) dans les comparaisons des fractions de cellules entières et d'ATAC-SN (FDR <0, 05). Bien qu'il représente une petite proportion du transcriptome total, nous avons étudié les moteurs de cette différence. Il y avait globalement un nombre plus élevé de gènes sous-exprimés dans l'ATAC-SN où le noyau est absent, par rapport à la fraction cellulaire entière. Un petit nombre de transcrits qui ont été appauvris dans l'ATAC-SN montrent une surreprésentation des processus biologiques et des fonctions moléculaires associées au noyau, y compris la division nucléaire, la membrane nucléaire, la modification des histones, l'organisation des chromosomes et la glycoprotéine. Bien que cela ne soit pas surprenant, comme ce compartiment est techniquement exclu, il apparaîtra donc comme DE, il existe des processus liés à ces transcriptions. Le taux de transport du noyau au cytoplasme peut avoir un impact sur le niveau de transcrits détectés dans les deux compartiments, et il a été rapporté que les molécules d'ARNm qui n'ont pas un besoin immédiat pour produire des protéines sont retenues dans le noyau57,58. Il a été démontré que la transcription chez les mammifères est un processus pulsatile impliquant des rafales stochastiques de production d'ARNm suivies d'intervalles de quiescence du promoteur59 et la compartimentation de l'ARNm agit pour amortir ces fluctuations transcriptionnelles dans le cytoplasme et éventuellement les niveaux de protéines58. La rétention nucléaire d'ARNm incomplètement épissés60, matures ou hyper-édités61 joue également un rôle important dans la régulation des gènes, permettant à la cellule de répondre rapidement au stress, à une infection virale ou à des stimuli environnementaux changeants62,63. Le modèle proposé pour la rétention nucléaire pourrait expliquer l'épuisement modeste des transcrits dans la fraction ATAC-SN. De plus, les transcrits avec un taux de dégradation intrinsèquement élevé dans le cytoplasme peuvent être détectés à des quantités inférieures dans le cytoplasme que les fractions cellulaires entières. De même, l'enrichissement des transcrits dans l'ATAC-SN par rapport à la fraction cellulaire entière pourrait être attribué à leur grande stabilité dans le cytoplasme et à leurs faibles taux de transcription. Inversement, conformément à Zaghlool et al.44, la fraction ATAC-SN dérivée du cytosol a montré un enrichissement en protéines mitochondriales codées par le noyau (NEMP). Les ARNm des NEMP étaient connus pour s'accumuler dans le cytoplasme jusqu'à ce que leur traduction soit requise par les mitochondries64 et ont une demi-vie d'ARNm significativement plus longue par rapport aux autres transcrits codant pour les protéines, ce qui soutient leur localisation préférentielle et prolongée dans l'ATAC-SN. Néanmoins, nos données suggèrent fortement que la majorité des transcrits présentent une représentation égale de l'abondance dans les deux compartiments. Nos résultats montrent qu'au niveau mondial, le transcriptome dérivé de l'ATAC-SN récapitule étroitement celui du lysat de cellules entières, démontrant la faisabilité et la fiabilité de l'utilisation du flux de travail combiné ATAC-SN et RNAseq pour une représentation à haute résolution des niveaux de régulation et d'expression des gènes dans cellules biobanquées. Cela indique que pour la plupart des transcrits, ni la localisation cellulaire sélective ni la stabilité de l'ARN n'altèrent leur distribution dans la cellule.

Bien que nous reconnaissions que la taille modeste de l'échantillon peut être une limitation potentielle de cette étude, nous démontrons une faisabilité et une fiabilité élevées du profilage de l'accessibilité de la chromatine à l'aide d'ATAC-seq sur des cellules primaires humaines récupérées à partir de matériaux biobanqués. Ces expériences ont été réalisées en utilisant 50 000 cellules, mais dans nos autres études, nous avons utilisé aussi peu que 25 000 cellules et obtenu des résultats similaires (données non présentées). Une autre limitation est que nous n'avons pas été en mesure d'examiner également la reproductibilité de ces approches omiques sur des échantillons de tissus normaux en raison des implications éthiques de l'échantillonnage d'individus en bonne santé, et peut-être que les biopsies tumorales fourniraient une ressource alternative pour tester cela. Cependant, notre étude est importante car elle montre que la cryoconservation n'altère pas les réponses cellulaires, le paysage de la chromatine et les signatures épigénétiques (signal d'accessibilité des gènes et occupation du TF) des cellules Treg primaires cryoconservées, et le protocole peut être utilisé par des groupes de recherche travaillant avec des cellules similaires. types d'intérêts.

En conclusion, ces résultats ont des implications importantes pour les études qui visent à obtenir simultanément l'accessibilité de la chromatine et le transcriptome à partir de ressources avec un matériel d'entrée limité, et jusqu'à ce que la profondeur, la résolution et les coûts associés aux technologies à cellule unique soient les mêmes que les approches en masse, il y aura toujours être un besoin de flux de travail qui peuvent utiliser du matériel biobanqué et effectuer une découverte parallèle. L'application de ces techniques au matériel biobanqué de cohortes de maladies sachant que les données du matériel congelé reflètent avec précision les cellules fraîchement isolées donne l'assurance que la découverte fournira un aperçu mécaniste précieux des profils moléculaires de la maladie, ouvrant la porte à de nouvelles cibles thérapeutiques et à une médecine personnalisée.

Des échantillons de sang total ont été prélevés avec le consentement éclairé de quatre donneurs adultes sains de sexe masculin âgés de 36 à 57 ans. Les échantillons n'étaient pas identifiables et aucune information personnelle n'a été recueillie dans le cadre de l'étude. Cette recherche a été approuvée par le Women's and Children's Health Network-Human Research Ethics Committee (WCHN-HREC) (code d'approbation : HREC/19/WCHN/65 ; date d'approbation : 11 juin 2019) et toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux lignes directrices et règlements. Les PBMC ont été isolés à partir de sang total frais obtenu à partir de donneurs adultes sains par centrifugation en gradient de densité en utilisant une solution de Ficoll-Paque. En bref, les échantillons de sang prélevés dans des tubes contenant de l'héparine ont été dilués à 1 × avec une solution saline tamponnée au phosphate et 35 mL de l'échantillon de sang dilué ont été déposés sur 15 mL de Ficoll-Paque™ PLUS dans des tubes Falcon de 50 mL, suivis d'une centrifugation à 800 xg. pendant 20 min dans un rotor à godets libres avec frein désactivé. La couche de cellules mononucléaires à l'interphase a été transférée dans un tube conique de 50 ml et complétée jusqu'à un volume final de 50 ml avec du PBS. Les PBMC ont été lavés deux fois par centrifugation à 500 xg à température ambiante pendant 10 min avec le frein activé. Les PBMC ont été divisés en deux groupes, la moitié pour le traitement frais et l'autre moitié pour la congélation/biobanque. Les échantillons à congeler ont été remis en suspension dans 1 mL de milieu de congélation (FCS inactivé par la chaleur contenant 10 % de DMSO) à une concentration de 1 × 107 cellules/mL, transférés dans un cryotube de 2 mL et placés dans un Mr. Frosty™ Freezing Container pour une congélation progressive jusqu'à − 80 °C à une vitesse de -1 °C/minute. Les cryovials ont ensuite été déplacés vers de l'azote liquide pour un stockage à long terme.

Les PBMC cryoconservés ont été retirés de l'azote liquide et décongelés dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min. Les PBMC décongelés ont été transférés dans un tube conique de 10 mL et dilués avec du milieu de culture complet X-VIVO 15 préchauffé (milieu sans sérum X-VIVO 15 additionné de 2 mM HEPES pH 7,8, 2 mM L-glutamine et 5 % de chaleur- sérum humain inactivé) à raison de 1 mL/5 s. Le tube conique de 10 ml contenant la suspension cellulaire a été doucement inversé pour mélanger et centrifugé à 500 xg pendant 10 min à température ambiante pour un total de deux lavages. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans un milieu de culture complet X-VIVO 15 préchauffé à 3–4 × 106/mL. Après décongélation, les PBMC ont été autorisés à récupérer pendant la nuit dans un milieu de culture complet X-VIVO 15 dans une plaque de culture à 24 puits avant FACS.

Après une nuit de repos en culture, des PBMC fraîchement isolés ou décongelés ont été lavés dans du PBS additionné de 2 % de FCS à 500 xg à température ambiante pendant 10 min. Les cellules ont été marquées avec les anticorps monoclonaux anti-humains conjugués au fluorochrome suivants : anti-CD4 (BD Biosciences, BUV395 Mouse Anti-Human), anti-CD25 (BD Biosciences, BV421), anti-CD127 (BD Biosciences, PE-CF594) et colorant de viabilité (BD Biosciences, BD Horizon Fixable Viability Stain 700) pour l'analyse FACS. Les cellules Treg ont été isolées en tant que population CD4 + CD25hi CD127dim à l'aide d'un cytomètre en flux BD FACSAria Fusion. Une fraction des populations isolées a été analysée pour la pureté cellulaire par cytométrie en flux. Après le tri des cellules, les cellules Treg ont été étalées à raison de 100 000 cellules par puits dans une plaque à fond en U à 96 puits et maintenues dans un milieu de culture complet X-VIVO 15 (milieu X-VIVO 15 additionné de 2 mM HEPES pH 7,8, 2 mM L-glutamine et 5 % de sérum humain inactivé par la chaleur) en présence de 500U/mL d'IL-2 humaine recombinante pendant 2 h à 37 oC dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 avant la préparation des cellules pour les expériences ATAC-seq et ARN-seq.

Après une récupération de 2 h après le tri, les cellules Treg ont été soit laissées non traitées, soit stimulées avec des billes conjuguées avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28, Gibco n° 11141D, Life Technologies) en X complet -Culture de VIVO 15 en présence de 500U/mL d'IL-2 humaine recombinante à un ratio cellule/bille de 1:1 pendant 48 h. Après 48 h, les Dynabeads ont été retirées du milieu de culture par séparation magnétique.

Des échantillons frais et décongelés ont été colorés avec les anticorps conjugués fluorescents suivants (CD25-BV421, CXCR3-BV650, CCR6-BV786, CCR10-BB515, CD127-PE-CF594, CCR4-PE-Cy7, FOXP3-AF647 (PCT), CD45RA- APC-H7) et le colorant de discrimination LIVE/DEAD-AF700. Des événements de lymphocytes T CD4+ viables (280 000) provenant d'échantillons frais (n = 4) et décongelés (n = 4) ont ensuite été exportés pour analyse t-SNE. Les marqueurs utilisés sont un panel phénotypique défini conçu pour déterminer des sous-populations distinctes dans les cellules T conventionnelles (Tconv) et T régulatrices (Treg) à l'aide de récepteurs de chimiokines. Les cellules Treg ont été définies à partir de l'expression de CD25+, CD127lo et FOXP3+. Le CD45RA est utilisé pour identifier les lymphocytes T naïfs (CD45RA+) et les lymphocytes T mémoire (CD45RA-). Les récepteurs de chimiokines CXCR3, CCR4, CCR6 et CCR10 sont inclus car ils sont connus pour être exprimés sur les sous-populations de la lignée auxiliaire Th1, Th2, Th17 et Th22 et peuvent être trouvés sur les cellules Treg selon un schéma similaire. L'expression de FOXP3 a été transformée de l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) en pourcentage du MFI maximum (désigné '' PCT '') de chaque fichier avant la concaténation des fichiers. Les MFI de CD25, CXCR3, CCR6, CCR10, CD127, CCR4, FOXP3 (PCT), CD45RA ont été utilisés dans l'apprentissage automatique t-SNE sur l'ensemble de données d'événements de cellules T CD4 + total (1, 12 × 106). L'ensemble de données a été échantillonné par intervalles à 100 000 événements avant d'être soumis à 700 itérations de l'équation tSNE avec les paramètres de perplexité suivants de 50 et une approximation de Barnes-Hut de 0,5. Les événements non échantillonnés résultant du sous-échantillonnage ont été estimés et tracés avec les 100 000 événements (FCS express v6). Cela permet de mapper des événements non échantillonnés à leur événement échantillonné le plus proche pour participer au calcul t-SNE. Les grappes de population cellulaire ont été déterminées à partir de la distribution et des combinaisons de marqueurs de fluorescence.

Omni ATAC-seq a été réalisé comme décrit précédemment avec des modifications mineures32. En bref, les cellules ont été prétraitées avec 200U/µL de DNase (Worthington) pendant 30 min à 37 °C avant l'expérience ATAC-seq. Les comptages cellulaires ont été effectués manuellement à l'aide d'un hémocytomètre et 50 000 cellules Treg ont été lysées dans 50 µL de tampon de resuspension froid (RSB : Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 10 mM et MgCl2 3 mM) additionné de 0,1 % de NP40, 0,1 % de Tween- 20 et 0,01 % de digitonine sur glace pendant 3 min. Immédiatement après la lyse, la réaction a été lavée avec 1 ml de RSB ATAC-seq contenant 0, 1% de Tween-20 par centrifugation à 500 xg pendant 10 min à 4 ° C. Après granulation des noyaux, le surnageant a été collecté et 3 volumes de réactif TRIzol LS (Invitrogen, 10296010) ont été ajoutés au surnageant (divisé en cinq tubes Eppendorf de 1,5 ml) et stockés à - 80 ° C pour les expériences RNA-seq. Les noyaux ont été remis en suspension dans 50 µL de mélange de transposition (30 µL de tampon 2 × TD, 3,0 µL de transposase Tn5, 16,5 µL de PBS, 0,5 µL de digitonine à 1 % et 0,5 µL de Tween-20 à 10 %). Le tampon TD et la transposase Tn5 ont été achetés auprès d'Illumina Inc. La réaction de transposition a été incubée à 37 ° C pendant 45 min dans un thermomélangeur avec un mélange à 1000 tr / min. La réaction a été purifiée à l'aide d'un kit Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (D4014). La préparation ultérieure de la bibliothèque ATAC-seq a été effectuée comme décrit32. Toutes les bibliothèques ont été amplifiées pour un total de 9 cycles de PCR et la sélection de taille a été effectuée à l'aide de SPRIselect (Beckman Coulter) pour inclure une fenêtre de taille de fragment de 100 à 800 pb avant le séquençage. Les bibliothèques de codes à barres ont été regroupées et séquencées sur une plate-forme Illumina NextSeq 550 High-Output à 75 cycles appariés jusqu'à une profondeur de lecture moyenne de 37,2 millions de lectures (± 6 millions) par échantillon (tableau supplémentaire 1).

Des profils d'ARN-seq ont été collectés à partir de 50 000 cellules entières (cellules Treg au repos et stimulées) et des fractions de surnageant (cellules Treg stimulées uniquement) à partir de réactions de lyse Omni ATAC-seq (ATAC-SN) pour 4 individus, dont 3 ont un ATAC-seq correspondant profils. Les échantillons ont été homogénéisés à l'aide du réactif TRIzol LS (Invitrogen, 10296010) et l'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit miRNeasy Micro (Qiagen; cat # 217084). L'intégrité de l'ARN a été déterminée par le kit Agilent RNA 6000 Pico à l'aide d'un bioanalyseur Agilent. Des échantillons avec un numéro d'intégrité de l'ARN (RIN)> 7,5 ont été utilisés pour le séquençage de l'ARNm. Les échantillons d'ARN ont été enrichis en ARN poly(A) à l'aide du module d'isolement magnétique d'ARNm NEBNext Poly(A) (New England Biolabs #E7490) avant la génération de bibliothèques d'ADNc à l'aide d'un kit de préparation de bibliothèque d'ARN NEBNext Ultra Directional II pour Illumina (New England Biolabs #E7760S) selon le protocole du fabricant. Les bibliothèques de codes-barres ont été regroupées et séquencées sur un séquenceur Illumina Hiseq X à 150 cycles appariés à une profondeur de lecture moyenne de 37,5 millions de lectures (± 16 millions) par échantillon.

L'analyse des données ATAC-seq a utilisé les outils et versions suivants : FastQC ver. 0.11.7, Samtools ver. 1.3.1, Picard ver. 2.2.4, Bowtie2 ver. 2.2.9, MACS2 ver. 2.1.2, BEDTools ver. 2.25.0, bedmap ver 2.4.36, Subread ver. 1.5.2.

La qualité des données de séquençage a été déterminée à l'aide de FastQC (ver. 0.11.7) suivi d'un ajustement des adaptateurs Nextera à l'aide de cutadapt (ver. 1.14). Les lectures coupées ont été alignées sur le génome GRCh37 à l'aide de Bowtie2 (ver. 2.2.9) avec le réglage « -X 2000 ». Pour chaque qualité d'échantillon, le découpage a été effectué avec l'option '-q 10' avec des lectures mappées non mappées et non primaires filtrées avec l'option '-F 2828' à l'aide de Samtools ver. 1.3.1. Les lectures appariées cartographiées de manière unique ont ensuite été filtrées pour exclure les doublons de PCR à l'aide de Picard ver. 2.2.4. Les lectures mitochondriales, la cartographie des lectures vers les régions de la liste noire ENCODE hg19 (régions avec un signal élevé anormal dans plusieurs tests génomiques et types de cellules) et les régions de la liste noire mitochondriale (régions à signal élevé sur le génome nucléaire en raison de l'homologie de séquence avec le génome mitochondrial) ont été filtrées à l'aide de BEDTools ver. 2.25.0. Après filtrage, une médiane de 28 millions de lectures (± 3 millions) de lectures par échantillon a été obtenue. Pour le pic d'appel et l'empreinte TF, les sites de démarrage de lecture ont été ajustés pour représenter le centre de l'événement de liaison de la transposase Tn5. Comme la transposase Tn5 se lie en tant que dimère et insère deux adaptateurs séparés de 9 bp65, toutes les lectures s'alignant sur le brin avant ont été décalées de + 4 bp alors que toutes les lectures s'alignant sur le brin inverse ont été décalées de - 5 bp.

Pour une accessibilité différentielle entre les échantillons Treg au repos et stimulés, les lectures ATAC-seq traitées représentant des échantillons frais et congelés provenant de repos ou stimulés ont été concaténées. Les pics ont été appelés à partir des fichiers bam fusionnés à l'aide de MACS2 ver. 2.1.266 avec les paramètres 'callpeak -f BAMPE -g hs -nolambda -min-length 100 -max-gap 50 -call-summits -bdg -keep-dup all -p 0.1'. Pour chaque ensemble de pics, les pics qui se chevauchent ont été fusionnés à l'aide de BEDTools ver. 2.25.0 et le nombre de lectures dans chaque mappage individuel d'échantillon/donneur à chaque pic a été calculé à l'aide de featureCounts67, en ne considérant que les fragments avec les deux extrémités alignées avec succès (-B) et avec des lectures chevauchant plusieurs fonctionnalités attribuées à la fonctionnalité avec le plus grand chevauchement ( -chevauchement le plus important). Les données de comptage ont ensuite été importées dans R et traitées à l'aide de edgeR68, supprimant tous les pics ayant moins de 3 comptes par million dans plus de trois échantillons. Les comptages ont été normalisés pour la taille de la bibliothèque d'échantillons et les dispersions communes, à tendance et par étiquette ont été calculées. L'analyse différentielle de l'accessibilité a été réalisée à l'aide de voom du package limma69. Une accessibilité différentielle significative a été définie comme les régions ayant un FDR Benjamini-Hochberg inférieur à 0,05 et un changement de facteur supérieur à 1,5. IGV ver. 2.5.2 (Broad Institute) et le navigateur du génome UCSC (Université de Californie à Santa Cruz) ont été utilisés pour la visualisation des pistes ATAC et ARN-seq. Les pics ont été annotés au TSS le plus proche à l'aide de ChIPpeakAnno70. HINT-ATAC40 a été utilisé pour appeler les empreintes sous les pics ATAC-seq à partir des données ATAC-seq avec les paramètres '-atac-seq -paired-end -organism = hg19'.

Tous les échantillons d'ARN-seq ont d'abord été validés pour une qualité constante à l'aide de FastQC v0.11.7 (Babraham Institute) en utilisant des paramètres par défaut. Les lectures brutes ont été coupées pour supprimer les adaptateurs et les bases de mauvaise qualité à l'aide de AdapterRemoval/2.2.1 avec les paramètres '-minquality 30 -minlength 50'. Les lectures ajustées pour l'adaptateur et la qualité ont ensuite été pseudo-alignées sur le génome humain GRCh38 à l'aide de Kallisto avec les paramètres '-b 50 et -fr-stranded'. En bref, les comptes bruts ont été importés et filtrés pour éliminer les gènes peu ou pas exprimés (moins de deux comptes par million dans tous les groupes expérimentaux). L'expression différentielle a été calculée à l'aide de voom from limma package69, les gènes ayant un taux de fausse découverte Benjamini-Hochberg (FDR) inférieur à 0,05 et un changement de pli supérieur à 1,5 étant considérés comme significatifs (sauf indication contraire). Les données ont été visualisées à l'aide de ggplot2 (ver. 3.0.0).

Les ensembles de données générés et analysés au cours de la présente étude sont disponibles dans le référentiel European Nucleotide Archive (ENA) avec le code d'accession PRJEB55015.

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Nous remercions Benjamin Ramoso, Alison Gwiazdzinski et Sarah Beresford (Étude ENDIA, WCH) pour leur aide dans la collecte de sang. Nous tenons à remercier tous les volontaires qui ont consenti à donner du sang pour cette étude. Nous remercions le Dr Randall Grose (SAHMRI Research and Core Facilities) pour son expertise en isolement cellulaire et en cytométrie en flux, le Dr Stephen Wilcox (WEHI Genomics Hub) et Genewiz pour le séquençage Illumina. Nous remercions également le Dr Kristian Handler (DZNE) et le Dr Simone Picelli (IOB) pour leur expertise et leurs conseils dans l'amélioration des procédures expérimentales pour la préparation et le séquençage de la bibliothèque ATAC-seq. Une partie de ce travail a été soutenue par l'étude ENDIA (Environmental Determinants of Islet Autoimmunity). L'étude ENDIA a été soutenue par FRDJ Australie, le récipiendaire de la subvention du Commonwealth d'Australie pour la recherche accélérée dans le cadre du Fonds pour l'avenir de la recherche médicale, et avec le financement du Leona M. et Harry B. Helmsley Charitable Trust (subvention # 3-SRA-2020 -966-MN). De plus, une partie de cette subvention a également été financée par une subvention de la Women's and Children's Hospital Research Foundation (Sadlon et Barry).

Institut de recherche Robinson, Université d'Adélaïde, Adélaïde, Australie

Ying Y. Wong, Jessica E. Harbison, Christopher M. Hope, Batjargal Gundsambuu, Katherine A. Brown, Soon W. Wong, Cheryl Y Brown, Jennifer J. Couper, Jimmy Breen, Ning Liu, Stephen M. Pederson, Timothy Sadlon & Simon C. Barry

Centre allemand des maladies neurodégénératives, Université de Bonn, Bonn, Allemagne

Maren Köhne, Kathrin Klee, Joachim Schultze & Marc Beyer

Hôpital pour femmes et enfants, North Adelaide, Australie

Jessica E. Harbison, Christopher M. Hope, Cheryl Y Brown, Jennifer J. Couper, Timothy Sadlon et Simon C. Barry

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YYW a contribué à l'acquisition, à l'interprétation des données NGS et à la rédaction du manuscrit. Le CMH a contribué à l'acquisition et à l'interprétation des données de phénotypage des cellules immunitaires par cytométrie en flux. JEH et JJC ont contribué à la méthodologie des biobanques. BG et CB ont contribué à la méthodologie de culture cellulaire et à l'interprétation des données. YYW a effectué l'analyse des données avec l'aide et les conseils de JB, NL, SMP et SWWKAB ont contribué à la révision du manuscrit. MB, JS, MK et KK ont dispensé une formation sur la préparation de la bibliothèque ATAC-seq et l'analyse des données. TS et SCB ont supervisé les expériences et contribué à l'interprétation des données et à la révision critique du manuscrit. SCB a dirigé le projet, finançant l'acquisition et d'autres ressources.

Correspondance à Simon C. Barry.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Wong, YY, Harbison, JE, Hope, CM et al. Récupération parallèle de l'accessibilité de la chromatine et de la dynamique de l'expression génique à partir de lymphocytes T régulateurs humains congelés. Sci Rep 13, 5506 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32256-6

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Reçu : 15 juillet 2022

Accepté : 24 mars 2023

Publié: 04 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-32256-6

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