Imagerie in vivo par bioluminescence de bactéries naturelles dans les tissus profonds via l'ATP

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2331 (2023) Citer cet article

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La plupart des méthodes d'imagerie par bioluminescence existantes ne peuvent visualiser l'emplacement des bactéries modifiées in vivo, excluant généralement l'imagerie des bactéries naturelles. Ici, nous tirons parti des transporteurs de sucre de cassette de liaison à l'ATP spécifiques aux bactéries pour internaliser la luciférase et la luciférine en les faisant de l'auto-stop sur la source de carbone unique des bactéries. Typiquement, les sondes bioluminescentes synthétisées sont constituées de nanoparticules de silicium modifiées par polymère de glucose (GP), luciférase, Cy5 et ICG et leurs substrats sont constitués de nanoparticules de silicium modifiées par GP et D-luciférine. Par rapport aux bactéries avec des mutations dans les transporteurs, qui internalisent à peine les sondes in vitro (c'est-à-dire ~ 2% du taux d'absorption), diverses bactéries pourraient engloutir les sondes de manière robuste avec un taux d'absorption élevé d'environ 50%. Notamment, la stratégie développée permet l'imagerie par bioluminescence ex vivo du vitré humain contenant dix espèces d'agents pathogènes prélevés chez des patients atteints d'endophtalmie bactérienne. En utilisant cette plate-forme, nous différencions davantage la néphrite et la colite bactériennes et non bactériennes chez la souris, tandis que leurs homologues chimiluminescents sont incapables de les distinguer.

Les micro-organismes ont de nombreux rôles vitaux dans la santé et la maladie1,2,3,4,5,6. L'activité bactérienne in vivo est fortement influencée par leur emplacement dans l'organisme hôte. Les méthodes d'imagerie clinique existantes telles que la tomodensitométrie (CT), l'imagerie par résonance magnétique (IRM) et peuvent fournir une imagerie non invasive des infections bactériennes dans le corps. Cependant, en raison de leur sélectivité relativement faible, ils sont incapables de distinguer l'inflammation causée par des infections bactériennes de l'inflammation causée par d'autres causes telles que le cancer ou les maladies auto-immunes7,8,9,10. Récemment, les techniques d'imagerie optique peuvent fournir des informations bactériennes localisées, qualitatives et quantitatives au niveau moléculaire11,12,13,14. En tant que méthode d'imagerie optique la plus largement utilisée, l'imagerie par fluorescence nécessite une excitation optique en temps réel, cependant, elle peut conduire à une autofluorescence de fond des tissus biologiques, entraînant un rapport signal-fond relativement faible15,16,17.

Attribuée à l'élimination d'une irradiation lumineuse externe, l'imagerie par bioluminescence (BLI) présente plusieurs avantages par rapport à l'imagerie par fluorescence, tels qu'un fond plus faible, une sensibilité plus élevée18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. À ce jour, les systèmes bioluminescents pour la détection des bactéries peuvent être essentiellement classés en deux types : (1) le système BLI endogène, qui implique le génie génétique des bactéries pour exprimer les luciférases29,30,31,32,33 ; (2) le système BLI exogène, dans lequel l'autoluminescence provient de l'oxydation des substrats exogènes de luciférine ou de luciférine en cage catalysée par la luciférase exogène en présence d'adénosine triphosphate (ATP) bactérienne produite par la lyse de bactéries34. Malgré les grands progrès du BLI, il présente des lacunes intrinsèques dans l'imagerie bactérienne, comme suit : "premièrement, les systèmes BLI endogènes ont besoin de la modification génétique des bactéries ; deuxièmement, les systèmes BLI exogènes ont besoin de la destruction des cellules bactériennes pour consommer le ATP intracellulaire", étant ainsi incapable d'imager des bactéries vivantes29,30,31,32,33,34.

Une manière théoriquement prometteuse mais méthodologiquement peu développée de visualiser diverses bactéries naturelles in vivo avec bioluminescence consiste à délivrer sélectivement un rapporteur bioluminescent dans des cellules bactériennes, en consommant directement l'ATP à l'intérieur des bactéries. Curieusement, la stratégie antibiotique du "cheval de Troie" pourrait délivrer des antibiotiques liés aux sidérophores dans le cytoplasme bactérien par l'intermédiaire des transporteurs de fer bactériens35,36,37,38,39,40,41. Dans nos travaux précédents, nous avons démontré que les nanosondes modifiées par le polymère de glucose (GP) peuvent être internalisées dans diverses bactéries par la voie du transporteur ABC spécifique aux bactéries, comme résumé dans le tableau supplémentaire 142,43,44,45. Cependant, l'utilisation d'une stratégie de "cheval de Troie" pour délivrer sélectivement des indicateurs bioluminescents dans des bactéries n'a pas, à notre connaissance, été rapportée auparavant.

Pour combler le vide technique, nous avons entrepris de livrer sélectivement la luciférase et la luciférine dans diverses bactéries naturelles par le biais de transporteurs de sucre à cassette de liaison à l'ATP (ABC), en les faisant de l'auto-stop sur des polymères de glucose à liaison glucosidique α (1-4) (équivalent dextrose de 4,0 ~7.0)-nanoparticules liées. La figure 1 illustre schématiquement que les bactéries Gram-négatives et Gram-positives pourraient activement engloutir les sondes bioluminescentes synthétisées (c'est-à-dire le polymère de glucose (GP), la luciférase, les nanoparticules de silicium modifiées Cy5 et ICG (GP-Si-BP)) et leurs substrats (Nanoparticules de silicium modifiées par GP et D-luciférine (GP-Si-Luc)). Le GP (par exemple, le poly[4-O-(α-D-glucopyranosyl)-D-glucopyranose]) sert de source de carbone omniprésente, qui peut être intériorisée de manière robuste dans les cellules bactériennes par le transporteur de sucre ABC9,42,46. En utilisant le transporteur de sucre ABC chez Escherichia coli (E. coli) comme exemple, il a cinq sous-unités : LamB, MalE, MalF, MalG et MalK. Parmi ces sous-unités, LamB est une porine de diffusion typique de la membrane externe, et MalE peut reconnaître les molécules GP liées α (1-4)-glucosidiquement47,48,49,50,51,52,53. En tirant parti de ce mécanisme d'absorption, il a récemment été démontré que les nanoparticules modifiées par GP de petite taille (par exemple, ~ 5 nm), y compris les nanoparticules de silicium, les nanoparticules d'or et les points de carbone, sont intériorisées de manière sélective et robuste dans les cellules bactériennes. De manière analogue, nous montrons ici que diverses bactéries mangent leurs « aliments » camouflés, c'est-à-dire les GP-Si-BP et GP-Si-Luc. Après internalisation dans les cellules bactériennes, la luciférine dans GP-Si-Luc est directement activée par l'ATP dans les bactéries, suivie de l'oxydation catalysée par la luciférase dans GP-Si-BP. En utilisant en outre un relais de transfert d'énergie, qui intègre le transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) entre la luciférase et Cy5 et le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) entre Cy5 et ICG, les sondes Trojan BLI développées permettent l'imagerie proche infrarouge (NIR) des bactéries dans tissus profonds. De plus, le chargement d'ICG permet la destruction photothermique des bactéries sous irradiation NIR. Nous démontrons que la stratégie BLI du cheval de Troie présentée permet l'imagerie par bioluminescence ex vivo de dix espèces de bactéries dans le vitré de patients atteints d'endophtalmie bactérienne. Nous démontrons également que la stratégie BLI du cheval de Troie présentée permet non seulement l'imagerie sélective et sensible, mais également la thérapie photothermique des agents pathogènes dans les tissus profonds, dans des modèles de preuve de concept de néphrite et de colite bactériennes chez la souris.

Les nanosondes sont constituées de nanoparticules de silicium modifiées GP, Cy5, ICG et luciférase (SiNPs) (GP-Si-BP) et de SiNPs modifiées GP, D-luciférine (GP-Si-Luc).

La figure 1 supplémentaire illustre étape par étape la voie de synthèse des GP-Si-BP et GP-Si-Luc. En bref, nous avons d'abord synthétisé des SiNP conjugués à GP (GP-SiNP) par la réaction de base de Schiff, dans laquelle la base de Schiff a été formée sur la base de la réaction entre les groupes aldéhyde de GP (0,56 mM, 100 µL) et les groupes amino sur le surface des SiNP (0,08 mM, 200 µL). Ensuite, en tirant parti de l'adsorption électrostatique, les molécules de colorant de Cy5 (0,56 mM, 2 µL) et ICG (0,56 mM, 12 µL) ont été adsorbées sur des GP-SiNP. En conjuguant davantage avec la luciférase de luciole (0,06 mM, 100 µL) via une réaction de condensation activée par N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthyl-carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS), nous avons finalement obtenu les sondes bioluminescentes des GP-Si-BP. De manière analogue, en conjuguant les GP-SiNPs avec la D-luciférine (0,30 mM, 100 µL) sur la base de la réaction de condensation EDC/NHS, nous avons synthétisé les substrats bioluminescents de GP-Si-Luc. Le rendement chimique de GP-Si-BP était de 76,1 % et le rendement chimique de GP-Si-Luc était de 78,8 %, qui ont été calculés selon le protocole rapporté54. Les quantités de GP, Cy5, ICG, luciférase, D-luciférine chargées sur les SiNP ont été strictement quantifiées par les courbes d'absorption d'étalonnage correspondantes (Fig. 2 supplémentaire). En règle générale, la quantité réelle de Cy5 adsorbée sur les GP-SiNP était d'environ 0, 0044 mM et la quantité réelle d'ICG adsorbée sur les GP-SiNP était d'environ 0, 026 mM. Pour obtenir la dose équivalente, l'absorbance détectée de Cy5 et d'ICG doit rester la même entre les groupes.

Comme le révèlent les images de microscopie électronique à transmission (TEM) et l'image TEM haute résolution des SiNP, GP-Si-BP et GP-Si-Luc (Fig. 2a) et la distribution de taille correspondante (Fig. 3 supplémentaire), la moyenne Le diamètre des GP-Si-BP était d'environ 2, 8 nm et le diamètre moyen de GP-Si-Luc était d'environ 2, 9 nm, tous deux légèrement plus grands que celui des SiNP nus (par exemple, ~ 2, 2 nm). Le diamètre hydrodynamique des GP-Si-BP, GP-Si-Luc et des SiNP purs était d'environ 5, 6 nm, d'environ 4, 1 nm et d'environ 3, 1 nm, mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Fig. 4 supplémentaire). La taille des particules mesurée par DLS est légèrement plus grande que celle en TEM, ce qui peut être dû à des états de surface différents du même échantillon dans les deux conditions de mesure. Plus précisément, le solvant dans l'échantillon doit être strictement éliminé pour la caractérisation TEM, ce qui donne un diamètre plus petit que celui mesuré par DLS, comme indiqué dans les rapports précédents55,56. De plus, nous avons systématiquement démontré la bonne stabilité de la luciférase et de la luciférine après la conjugaison des SiNPs (Fig. 5 supplémentaire).

a Images TEM et images TEM haute résolution de SiNPs, GP-Si-BPs et GP-Si-Luc. Barre d'échelle, 20 nm et 1 nm. b Images TEM à champ sombre annulaire à angle élevé (HAADF-STEM) de MDR E. coli ou MRSA traité par PBS, 0,06 mM de Si-BP, Si-Luc, GP-Si-Luc, GP-Si-BP à 37 oC pendant 2,5 h. Après incubation, les bactéries traitées ont été rincées plusieurs fois avec du tampon PBS. La concentration de cellules bactériennes est d'environ 1,0 × 107 UFC. Barre d'échelle, 200 nm. c Signaux bioluminescents de MDR E. coli avec différents traitements comme indiqué. Après incubation, les bactéries traitées ont été rincées avec du tampon PBS plusieurs fois, suivies d'une imagerie (IVIS Lumina III). Toutes les expériences d'imagerie ont été répétées trois fois avec des résultats similaires. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une analyse ANOVA unidirectionnelle. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SD (n = 3). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. Les dessins animés sont créés par le professeur Houyu Wang.

Pour déterminer principalement si les GP-Si-BP et les GP-Si-Luc pouvaient pénétrer dans les bactéries naturelles, deux cellules d'Escherichia coli multirésistantes (E. coli MDR) et de Staphylococcus aureus (SARM) d'origine clinique ont été isolées pour les éléments suivants expériences. Ils ont été obtenus auprès de patients atteints de kératite qui ont été diagnostiqués et traités à l'hôpital des yeux, des oreilles, du nez et de la gorge de Shanghai, Université de Fudan. Les souches isolées (~ 1, 0 × 107 UFC) ont été incubées avec GP-Si-BP (0, 06 mM), GP-Si-Luc (0, 06 mM) à 37 ° C pendant 2, 5 h, puis ont été lavées plusieurs fois avec du tampon PBS. Les images au microscope électronique à balayage (SEM) de la Fig. 6 supplémentaire ont montré que la surface et la morphologie des cellules MDR E. coli et MRSA traitées étaient comparables à celles non traitées. Comme le montre la cartographie élémentaire dans les images au microscope électronique à transmission à champ sombre annulaire à angle élevé (HAADF-STEM) (Fig. 2b), des éléments de carbone, d'azote et d'oxygène sont apparus dans chaque groupe, tandis que des éléments de silicium n'existaient que dans les bactéries traitées. avec GP-Si-BP ou GP-Si-Luc. Apparemment, les signaux de silicium observés ont été attribués aux SiNP dans les GP-Si-BP ou GP-Si-Luc, démontrant ainsi directement l'internalisation des GP-Si-BP ou GP-Si-Luc dans les cellules bactériennes. Enfin, le BLI ex vivo des bactéries traitées a révélé que la luminescence distincte n'était trouvée que dans le groupe GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, qui était environ 10 fois plus fort que les autres groupes (Fig. 2c). La luminosité élevée était due à la quantité d'ATP, qui était nécessaire pour activer la luciférine dans la réaction d'émission de lumière médiée par la luciférase, exactement environ 10 fois plus élevée à l'intérieur de la bactérie qu'à l'extérieur (Fig. 7 supplémentaire). La teneur en ATP a été déterminée par le kit de dosage ATP. Fait intéressant, des signaux bioluminescents comparables ont été observés dans les bactéries lysées lors de l'ajout de sondes sans modification des molécules de GP (Si-BP + Si-Luc) (Fig. 2c). Nous avons également traité les bactéries avec l'inhibiteur ATP du DCC (Dicyclohexylcarbodiimide) avant incubation avec GP-Si-BPs + GP-Si-Luc. Comme prévu, aucun signal distinct n'est apparu (Fig. 8 supplémentaire). Ces résultats ont prouvé ensemble que les sondes Trojan BLI construites pénétraient effectivement dans les bactéries et que la luminosité de la bioluminescence produite dépendait de la quantité d'ATP à l'intérieur des bactéries.

Dans les sondes bioluminescentes développées, les SiNP de base ont servi de vecteurs pour charger les indicateurs bioluminescents. Les indicateurs bioluminescents comprenaient la source d'autoluminescence de la luciférase (λem = 560 nm) et deux colorants organiques de Cy5 (λex = 646 nm, λem = 664 nm) et ICG (λex = 780 nm, λem = 840 nm) (Fig. .3a). Bénéficiant du chevauchement suffisant des bandes d'émission et d'absorption, l'émission NIR peut être obtenue sur la base d'un processus de relais de transfert d'énergie à double résonance, combinant BRET entre la luciférase et Cy5, et FRET entre Cy5 et ICG (Fig. 3b). Comme le révèle plus en détail la figure 3c, lorsque le rapport de Cy5 à ICG était de 1: 6, l'efficacité de transfert d'énergie la plus élevée peut être obtenue. En règle générale, l'efficacité FRET optimale entre Cy5 et ICG a été déterminée comme étant de 32 % et la distance de Förster correspondante (R0) a été calculée comme étant de 1,03 nm, garantissant une émission efficace dans la région NIR. Comme le révèle la figure 3d, l'intensité bioluminescente des GP-Si-BP + GP-Si-Luc s'est améliorée de manière linéaire avec l'augmentation de la concentration d'ATP, suggérant une manière dépendante du contenu en ATP des GP-Si-BP. Lors de l'ajout de D-luciférine (150 µM) et d'ATP (10 µM), la photostabilité des GP-Si-BP (0, 06 mM) a été testée plus avant. Comme le révèle la figure 3e, le système BLI présentait une stabilité de bioluminescence relativement bonne, conservant 84% du signal normalisé après 120 min, car la réaction enzymatique entre la luciférine et la luciférase était maintenue de manière stable car elle n'était pas affectée par l'énergie externe (par exemple, irradiation lumineuse ). Au contraire, le signal normalisé de l'ICG dans les GP-Si-BP a fortement diminué de 26 % sous irradiation continue à 808 nm pendant 120 min, car l'irradiation continue à 808 nm de l'ICG était responsable d'un effet potentiel de blanchiment et d'extinction pour une émission réduite. Ensuite, nous avons examiné la profondeur de pénétration tissulaire des GP-Si-BP. Expérimentalement, des GP-Si-BP (0,06 mM) mélangés à de la D-luciférine (150 µM) et de l'ATP (10 µM) dans une plaque noire à 96 puits ont été recouverts par le tissu de poitrine de poulet de différentes épaisseurs, suivi de l'enregistrement de signaux bioluminescents et signaux fluorescents sous irradiation à 808 nm. Comme le révèle la figure 3f, le signal bioluminescent normalisé a diminué parallèlement à l'augmentation de l'épaisseur du tissu mammaire de poulet allant de 0 à 35 mm. En règle générale, lorsque l'épaisseur atteignait 30 mm, l'intensité bioluminescente normalisée des GP-Si-BP était encore significativement supérieure à celle du groupe d'imagerie d'émission NIR basé sur l'ICG (p <0, 0001). De manière analogue, la profondeur de pénétration tissulaire des GP-Si-BP était significativement plus grande que celle des GP-Ce6-SiNP, comme indiqué dans la Fig. 9 supplémentaire. En règle générale, lorsque l'épaisseur était de 5 mm, le signal fluorescent des GP-Ce6-SiNP était indétectable. Les bonnes profondeurs de pénétration des GP-Si-BP constituent la base des applications d'imagerie in vivo ultérieures dans les tissus profonds. Enfin, nous avons testé la capacité photothermique des GP-Si-BP in vitro en utilisant une caméra thermique IR. Comme le montre la figure 3g, h, la température de la solution GP-Si-BPs (0, 06 mM) pourrait rapidement grimper à 61 oC sous irradiation laser à 808 nm pendant 5 min, suggérant la thérapie photothermique potentielle (PTT) de GP-Si -BPs contre les bactéries.

un spectre d'absorption et d'émission UV-vis de Cy5, ICG et bioluminescence de la luciférase. Les lignes pointillées et pleines se réfèrent respectivement aux spectres d'absorption et d'émission. b Un schéma illustrant le mécanisme d'un relais de transfert d'énergie intégrant BRET et FRET dans la stratégie développée. c Spectres de fluorescence de GP-Si-BP avec différents rapports de Cy5 à ICG. d Signaux bioluminescents de GP-Si-BP + GP-Si-Luc en fonction de la concentration en ATP (moyenne ± SD, n = 3). e, f Images de bioluminescence et de fluorescence (excitation : 780 nm) résolues dans le temps (e) et en fonction de l'épaisseur du tissu de poitrine de poulet (f) et signal normalisé correspondant pour la comparaison quantitative du changement de signal de bioluminescence et de fluorescence. Le signal normalisé en (e) est défini comme le rapport de l'intensité d'émission détectée à tout moment à l'intensité d'émission détectée à 5 min. Le signal normalisé en (f) est défini comme le rapport de l'intensité d'émission détectée à n'importe quelle épaisseur de tissu à l'intensité d'émission détectée à 0 mm. La bioluminescence est produite par le mélange de GP-Si-BP (0,06 mM), de D-luciférine (150 µM) et d'ATP (10 µM). Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SD (n = 3). g Les images de chauffage photothermique de PBS, GP-Si-BP sous l'irradiation d'un laser à 808 nm. h Les courbes de chauffage photothermique de PBS, GP-Si-BP sous l'irradiation d'un laser à 808 nm. Toutes les expériences d'imagerie ont été répétées trois fois avec des résultats similaires. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une analyse ANOVA unidirectionnelle. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour optimiser la quantité de GP lié et le temps d'incubation, l'efficacité d'absorption des GP-Si-BP par les bactéries a été systématiquement étudiée en utilisant une analyse par cytométrie en flux. Comme le révèle la Fig. 10 supplémentaire, le taux d'absorption d'environ 1,0 × 107 UFC de MDR E. coli a atteint sa valeur maximale (par exemple, 48,5 % de SARM et 48,8 % de MDR E. coli) lorsque les bactéries ont été incubées avec le GP-Si-BP contenant une concentration de GP de 0,56 mM pendant 2,5 h. Le taux d'absorption n'a pas augmenté de manière significative lors de l'augmentation supplémentaire de la concentration de GP et du temps d'incubation, indiquant qu'un état de saturation a été atteint dans ces circonstances. Des tendances similaires ont également été observées dans GP-Si-Luc. En conséquence, 0,56 mM de GP et 2,5 h d'incubation ont été utilisés dans les expériences suivantes.

Ensuite, nous avons démontré si GP-Si-BPs et GP-Si-Luc pouvaient cibler diverses bactéries naturelles. À cette fin, nous avons sélectionné deux bactéries Gram-négatives, à savoir E. coli MDR d'origine clinique, Salmonella typhimurium (STm) et deux bactéries Gram-positives, à savoir SARM et Staphylococcus aureus (S. aureus) d'origine clinique. Comme le révèlent les images de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) de la Fig. 4a et de la Fig. 11a supplémentaire, nous avons pu observer les signaux fluorescents rouges distincts (attribués à l'ICG, λex = 780 nm, λem = 800-840 nm) dans le SARM, MDR E. coli, S. aureus et STm après 2,5 h d'incubation avec GP-Si-BP (0,06 mM). Quantitativement, la cytométrie en flux correspondante a révélé que l'efficacité d'absorption des GP-Si-BP était de 52,7 % par SARM, 49,6 % par MDR E. coli, 53,5 % par S. aureus et 47,1 % par STm, respectivement. De manière analogue, nous avons pu détecter de forts signaux fluorescents verts (attribués à la D-luciférine, première colonne, λex = 328 nm, λem = 530–560 nm) dans MRSA, MDR E. coli, S. aureus et STm après 2,5 h d'incubation avec GP-Si-Luc (0, 06 mM) (Fig. 4b et Fig. 11b supplémentaire). En outre, l'efficacité d'absorption relativement élevée de GP-Si-Luc a été déterminée dans le SARM (48,1 %), le MDR E. coli (45,7 %), le S. aureus (47,2 %) et le STm (48,9 %) respectivement. Comme prévu, des signaux verts et rouges peuvent être observés dans le SARM, MDR E. coli, S. aureus et STm traités avec GP-Si-BP (0,06 mM) et GP-Si-Luc (0,06 mM) (GP-Si -BPs + GP-Si-Luc) pendant 2,5 h (Fig. 4c et Fig. 11c supplémentaire). Au contraire, nous ne pouvons pas observer de signaux fluorescents détectables dans les bactéries traitées avec les nanoagents sans la modification des molécules de GP (c'est-à-dire, Si-Luc, Si-BPs ou Si-Luc + Si-BPs) (Figures supplémentaires 12 & 13). Ces résultats ont principalement confirmé la capacité de ciblage des bactéries des ligands GP.

a Images de fluorescence confocale de MRSA ou MDR E. coli après incubation avec 0,06 mM GP-Si-BP et analyse correspondante par cytométrie en flux des taux d'absorption. b Images de fluorescence confocale de MRSA ou MDR E. coli après incubation avec 0,06 mM GP-Si-Luc et analyse correspondante par cytométrie en flux des taux d'absorption. c Images de fluorescence confocale de MRSA ou MDR E. coli après incubation avec 0,06 mM GP-Si-Luc + GP-Si-BP. d, e Images de fluorescence confocale de bactéries mutantes de ΔlamB et ΔmalE après incubation avec 0,06 mM GP-Si-BP (d) ou GP-Si-Luc (e). La concentration de cellules bactériennes est d'environ 107 UFC. Barre d'échelle, 25 μm. f Images de bioluminescence de tampon PBS contenant MRSA ou MDR E. coli avec différentes concentrations après incubation avec 0,06 mM GP-Si-Luc + GP-Si-BP. g Imagerie par bioluminescence ex vivo du vitré humain contenant Enterococcus faecalis (1), Klebsiella pneumoniae (2), Streptococcus pneumoniae (3), Neisseria meningitidis (4), Haemophilus influenzae (5), Streptococcus pyogenes (6), Vancomycine (Van)- entérocoques résistants (7), Staphylococcus aureus multirésistant (SARM) (8), Moraxella catarrhalis (9) ou Salmonella para-typhi A (10) prélevés chez des patients atteints d'endophtalmie bactérienne. Le vitré sans bactérie (0) d'un volontaire sain a été défini comme témoin. Toutes les expériences d'imagerie ont été répétées trois fois avec des résultats similaires.

Pour démontrer davantage si GP-Si-BP et GP-Si-Luc ciblaient les bactéries via le transporteur de sucre ABC, nous avons construit deux types de mutants bactériens, c'est-à-dire un mutant de délétion pour delta-lamB (ΔlamB) et un mutant de délétion pour delta-malE (ΔmalE), suivie d'une incubation avec GP-Si-BP ou GP-Si-Luc. Les données de séquençage de Sanger (Notes supplémentaires) ainsi que les données de PCR (Fig. 14 supplémentaire) ont vérifié la construction réussie de ΔlamB et ΔmalE. Comme prévu, nous n'avons observé aucun signal fluorescent dans ΔlamB ou ΔmalE traités avec GP-Si-BP (Fig. 4d) ou GP-Si-Luc (Fig. 4e). Les résultats de la cytométrie en flux étaient en accord avec les images CLSM (Fig. 15 supplémentaire). De plus, nous avons étudié plus avant si différents sucres (par exemple, GP, glucose et maltotriose) affecteraient l'absorption des GP-Si-BP par les transporteurs de sucre ABC. Comme le révèle la Fig. 16 supplémentaire, l'absorption de GP-Si-BP a été inhibée par un excès de GP ou de maltotriose plutôt que de glucose. Comme indiqué précédemment, les transporteurs de sucre ABC permettaient le transport non seulement du maltose, mais également des polymères de glucose à liaison linéaire (1-4)-glucosidiquement, tels que les maltodextrines, l'amylose et l'amidon, ainsi que des cyclodextrines (1-4)-glucosidiquement liées57, 58. Ensemble, ces résultats ont prouvé que le mécanisme d'absorption des sondes Trojan BLI dans les bactéries se faisait bien par la voie du transporteur de sucre ABC.

Enfin, nous avons démontré la bonne spécificité des GP-Si-BP et GP-Si-Luc pour les bactéries par rapport aux cellules de mammifères. En règle générale, les échantillons de sang humain dopés avec E. coli MDR ou SARM ont été incubés avec GP-Si-BP (0,06 mM), GP-Si-Luc (0,06 mM) ou GP-Si-BP + GP-Si-Luc (0,06 mM ) pendant 2,5 h puis lavé avec du tampon PBS. Comme indiqué dans la Fig. 17 supplémentaire, des signaux de fluorescence verte et rouge n'ont été observés que dans les cellules bactériennes plutôt que dans les cellules sanguines humaines. Ces résultats ont démontré que les GP-Si-BP ou GP-Si-Luc étaient à peine internalisés par les cellules de mammifères en raison de l'absence de transporteurs de sucre ABC dans les cellules de mammifères.

Pour déterminer la limite de détection, nous avons imagé une série de concentrations de MRSA et MDR E. coli dans un tampon PBS incubé avec des sondes Trojan BLI (Fig. 4f). En règle générale, les bactéries à des concentrations aussi faibles que ~ 106 UFC ont produit un signal détectable. Sur cette base, nous avons en outre démontré que la stratégie BLI du cheval de Troie présentée permettait l'imagerie par bioluminescence ex vivo de dix types d'agents pathogènes dans le vitré collectés chez des patients atteints d'endophtalmie bactérienne, et les agents pathogènes imagés étaient Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Enterococcus résistant à la vancomycine (Van), Staphylococcus aureus multirésistant (SARM), Moraxella catarrhalis et Salmonella para-typhi A, comme le révèle la Fig. 4g. Ces agents pathogènes ont été confirmés par culture bactérienne, également fournie par l'hôpital des yeux, des oreilles, du nez et de la gorge de Shanghai, Université de Fudan. Ces résultats impliquaient le potentiel de la stratégie BLI du cheval de Troie dans le diagnostic bactérien clinique.

Ensuite, nous avons témoigné de la faisabilité de la stratégie proposée sur l'imagerie bioluminescente de bactéries naturelles dans les tissus profonds. À cette fin, nous avons d'abord construit un modèle de preuve de concept de la néphrite induite par S. aureus chez la souris (Fig. 18a supplémentaire). La concentration réelle de S. aureus au site d'infection pendant l'imagerie était d'environ 1,0 × 108 UFC. Nous avons constaté que les signaux de bioluminescence les plus forts n'apparaissaient dans les sites infectés que dans les groupes GP-Si-BP + GP-Si-Luc (Fig. 5a). Quantitativement, l'intensité du signal dans les groupes GP-Si-BP + GP-Si-Luc était environ 3 fois plus forte que celle dans les groupes GP-Si-BP + Si-Luc. Nous avons également pu observer des résultats similaires dans l'imagerie ex vivo des tissus rénaux prélevés (Fig. 19 supplémentaire). De plus, aussi bas que ~ 1, 0 × 106 UFC S. aureus dans le rein pourrait être discriminé par la stratégie de cheval de Troie développée (Fig. 5b), et une telle sensibilité devrait être suffisante pour de nombreux scénarios in vivo. Pour démontrer l'imagerie sélective de la stratégie Trojan BLI développée contre la néphrite bactérienne par rapport à une autre néphrite, nous avons ensuite construit une colite causée par la glycérine chez la souris (Fig. 18b supplémentaire). Comme prévu, nous avons constaté que les signaux bioluminescents chez les souris porteuses de néphrite à S. aureus traitées avec GP-Si-BPs + GP-Si-Luc étaient significativement plus lumineux que les souris témoins et porteuses de néphrite à glycérine traitées avec GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (p < 0,001) (Fig. 5c). Pour une comparaison plus approfondie, nous avons également utilisé un autre réactif d'auto-luminescence de luminol pour imager des souris porteuses de néphrite à S. aureus (Fig. 18c supplémentaire) ou des souris porteuses de néphrite à la glycérine (Fig. 18d supplémentaire). Comme indiqué précédemment, le luminol pourrait être catalysé par la myéloperoxydase (MPO) pour produire une luminescence59,60. Distingué de la stratégie Trojan BLI développée dans l'image sélective de la néphrite à S. aureus, le luminol pourrait produire de forts signaux luminescents à la fois chez les souris porteuses de la néphrite à S. aureus et les souris porteuses de la néphrite à la glycérine (Fig. 5d). Ces résultats ont démontré que la stratégie Trojan BLI développée pouvait faire la distinction entre la néphrite bactérienne et les autres néphrites. La sélectivité élevée ainsi que la sensibilité ajustable de la stratégie développée ont été attribuées à l'internalisation sélective des sondes Trojan BLI dans les cellules bactériennes. De plus, nous avons systématiquement comparé le système de SiNPs modifiés GP et Ce6 (GP-Ce6-SiNPs) rapporté précédemment (simplement excitation de Ce6)39, le système Trojan BLI et l'imagerie d'émission NIR basée sur l'ICG dans l'imagerie de la néphrite à S. aureus ( Fig. 20 supplémentaire). Bien que le système GP-Ce6-SiNPs et l'imagerie d'émission NIR basée sur l'ICG aient permis la détection de l'absorption bactérienne de nanoagents dans le rein en raison de la capacité de localisation bactérienne spécifique des ligands GP, la stratégie Trojan BLI présentait des rapports signal sur bruit 3,75 fois plus élevés que celle obtenue par le système GP-Ce6-SiNPs et des rapports signal sur bruit 3,46 fois supérieurs à ceux obtenus par l'imagerie d'émission NIR basée sur l'ICG. Pris ensemble, nous avons utilisé Trojan BLI plutôt que l'imagerie d'émission basée sur Ce6 ou ICG dans la détection de la néphrite à S. aureus en raison de l'imagerie à contraste élevé du système Trojan BLI.

a Imagerie par bioluminescence de la néphrite induite par S. aureus (~ 1, 0 × 108 UFC) chez la souris avec différents traitements, comme indiqué. Les souris infectées ont reçu une injection de GP-Si-BPs + PBS, GP-Si-BPs + Si-Luc, GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, Si-BPs, GP-Si-Luc et Si-BPs + Si-Luc à la même dose respectivement (moyenne ± SD, n = 3). b Imagerie par bioluminescence de la néphrite induite par S. aureus (~ 1, 0 × 106 UFC) chez la souris avec différents traitements, comme indiqué. Les souris infectées ont reçu une injection de GP-Si-BPs + PBS, GP-Si-BPs + Si-Luc, GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, Si-BPs, GP-Si-Luc et Si-BPs + Si-Luc à la même dose, respectivement (moyenne ± SD, n = 3). c Imagerie par bioluminescence de souris saines (contrôle), de souris porteuses de néphrite à la glycérine et de souris porteuses de néphrite à S. aureus à l'aide des sondes Trojan BLI (moyenne ± SD, n = 3). d Imagerie de luminescence de souris saines (contrôle), de souris porteuses de néphrite à la glycérine et de souris porteuses de néphrite à S. aureus par administration intrapéritonéale de luminol (282 mM, 200 μL) (moyenne ± SD, n = 3). Toutes les expériences d'imagerie ont été répétées trois fois avec des résultats similaires. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une analyse ANOVA unidirectionnelle. Les barres d'erreur représentent l'écart type obtenu à partir de trois mesures indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour confirmer la généralité de la stratégie développée dans l'imagerie de bactéries naturelles dans les tissus profonds, nous avons construit un autre modèle de preuve de concept de colite induite par STm chez la souris (Fig. 21a supplémentaire). La quantité réelle de STm au site d'infection pendant l'imagerie a été déterminée à environ 1,0 × 109 UFC. Comme le révèle la figure 6a, nous avons observé des signaux bioluminescents beaucoup plus forts dans les groupes GP-Si-BP + GP-Si-Luc que dans les autres groupes (p <0, 0001). Des résultats cohérents ont été observés dans l'imagerie ex vivo des tissus intestinaux isolés (Fig. 6b). Pour témoigner de la sélectivité de la stratégie Trojan BLI développée contre la colite bactérienne par rapport à d'autres colites, nous avons construit une colite induite par le sulfate de dextran sodium (DSS) chez la souris (femelle, âgée de 6 à 8 semaines, n = 3) (Fig. 21b supplémentaire). Les souris porteuses de colite DSS ont été traitées avec GP-Si-BPs + GP-Si-Luc dans des conditions identiques. En effet, les signaux bioluminescents dans les groupes STm traités avec GP-Si-BPs + GP-Si-Luc étaient significativement plus forts que les groupes témoins et DSS traités avec GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (p < 0,001) (Fig. 6c). Nous avons également utilisé du luminol pour imager des souris porteuses de colite STm (Fig. 21c supplémentaire) ou des souris porteuses de colite DSS (Fig. 21d supplémentaire) pour une comparaison plus approfondie. Comme prévu, par rapport aux signaux ignorables dans les groupes témoins, nous avons observé de forts signaux luminescents chez les souris porteuses de colite STm traitées avec du luminol (p <0,0001) et les souris porteuses de colite DSS traitées avec du luminol (p <0,01) (Fig. 6d) . Ces résultats ont démontré ensemble que la stratégie Trojan BLI développée pouvait faire la distinction entre la colite bactérienne et les autres colites. Nous avons également démontré que la stratégie Trojan BLI développée permettait une image à long terme et en temps réel de la colite STm chez la souris (Fig. 6e). Typiquement, nous pouvions encore observer des signaux distincts à 1 h après l'administration de GP-Si-Luc. Cette luminescence persistante observée ainsi que la bonne spécificité ont été attribuées à l'accumulation sélective de sondes Trojan BLI dans les cellules bactériennes des tissus intestinaux infectés. De plus, nous avons systématiquement comparé le système GP-Ce6-SiNPs (simplement excitation de Ce6) 42, la stratégie Trojan BLI et l'imagerie d'émission NIR basée sur l'ICG dans l'imagerie de la colite STm (Fig. 22 supplémentaire). Comme prévu, la stratégie Trojan BLI présentait des rapports signal sur bruit 4,05 fois plus élevés que ceux obtenus par le système GP-Ce6-SiNPs et des rapports signal sur bruit 3,45 fois plus élevés que ceux obtenus par l'imagerie d'émission NIR basée sur l'ICG. Ainsi, nous avons utilisé Trojan BLI au lieu de l'imagerie d'émission basée sur Ce6 ou ICG dans la détection de la colite STm en raison de l'imagerie à contraste élevé du système Trojan BLI.

a Imagerie par bioluminescence de la colite induite par STm (~ 1, 0 × 109 UFC) chez la souris avec différents traitements, comme indiqué. Les souris infectées ont reçu une injection de GP-Si-BPs + PBS, GP-Si-BPs + Si-Luc, GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, Si-BPs, GP-Si-Luc et Si-BPs + Si-Luc à la même dose respectivement (moyenne ± SD, n = 3). b Images luminescentes ex vivo correspondantes de tissus intestinaux isolés de souris porteuses de colite STm avec différents traitements, comme indiqué. c Imagerie par bioluminescence de souris saines (contrôle), de souris porteuses de colite DSS et de souris porteuses de colite STm basée sur les sondes Trojan BLI (moyenne ± SD, n = 3). d Imagerie de luminescence de souris saines (contrôle), de souris porteuses de colite DSS et de souris porteuses de colite STm par administration intrapéritonéale de luminol (282 mM, 200 μL) (moyenne ± SD, n = 3). e Imagerie bioluminescente en accéléré de la colite induite par STm (~ 1,0 × 109 UFC) chez la souris basée sur les sondes Trojan BLI. Toutes les expériences d'imagerie ont été répétées trois fois avec des résultats similaires. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une analyse ANOVA unidirectionnelle. Les barres d'erreur représentent l'écart type obtenu à partir de trois mesures indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Outre l'imagerie par bioluminescence des bactéries, les GP-Si-BP construits possédaient également le potentiel de bactéries inactives en raison des effets photothermiques provenant de l'ICG dans les GP-Si-BP. Comme le révèlent les images SEM de bactéries (par exemple, E. coli, S. aureus) (Fig. 23a supplémentaire), nous avons observé des cellules bactériennes ridées ou lysées uniquement dans les groupes dans lesquels les bactéries ont été incubées avec des GP-Si-BP (0,06 mM) pendant 2,5 h puis irradié par un laser à 808 nm (1,0 W cm-2) pendant 5 min. Nous avons montré les preuves solides soulignant la supériorité des GP-Si-BP par rapport aux antibiotiques utilisés en clinique (par exemple, la vancomycine (Van), l'ampicilline (Ampi)) (Fig. 23b supplémentaire). Dans l'ensemble, la stratégie présentée présente deux avantages distincts par rapport aux antibiotiques pour tuer les bactéries : (1) les GP-Si-BP peuvent tuer les bactéries Gram-positives ainsi que les bactéries Gram-négatives, tandis que la vancomycine n'est utilisable que pour les bactéries Gram-positives (par exemple, S. aureus, M. luteus et SARM); (2) la stratégie développée montre des taux antibactériens dominants (par exemple,> 90%) lors d'un traitement de courte durée (par exemple, 2 h et 30 min), tandis que la vancomycine ou l'ampicilline même à 15 µg mL-1 affiche des taux antibactériens inférieurs même le le temps de traitement peut aller jusqu'à 7 h (par exemple, < 65 %) (Figs. 23c et 23d supplémentaires). Ces résultats démontrent de manière convaincante l'utilité de tels traitements pour tuer les bactéries par rapport aux antibiotiques.

Pour évaluer la capacité antibactérienne de la stratégie développée in vivo, nous avons examiné son efficacité photothermique dans le modèle de preuve de concept de la néphrite bactérienne chez la souris (Fig. 24 supplémentaire). Nous avons également excisé les tissus rénaux infectés après le traitement, puis homogénéisé et cultivé les homogénats sur des plaques. Comme le révèlent les figures 7a, b, nous avons constaté que des colonies sporadiques existaient dans le groupe laser GP-Si-BP + 808 nm après 7 jours de traitement. Quantitativement, le taux antibactérien in vivo des GP-Si-BP sous irradiation laser contre S. aureus a été calculé à 96,0 %. Conformément aux expériences sur plaque de gélose, les données de coloration à l'hématoxyline-éosine (H&E) (Fig. 7c) ont montré que la texture claire des tissus et l'absence de nécrose cellulaire n'étaient trouvées que dans le groupe laser GP-Si-BP + 808 nm. Les effets PPT ont contribué aux taux élevés d'antibactériens. Nous avons utilisé une caméra thermique IR pour enregistrer les images photothermiques in vivo. Comme le montre la figure 7d, l'augmentation rapide de la température ne s'est produite que dans le groupe laser GP-Si-BP + 808 nm. En particulier, la température rénale pourrait augmenter à 52 oC après 5 min d'irradiation dans ce groupe. Pendant ce temps, la stratégie Trojan BLI développée a également permis la visualisation dynamique de l'effet antibactérien chez la souris. Expérimentalement, des souris ont reçu une injection intrapéritonéale de la même dose de GP-Si-Luc après chaque irradiation, suivie d'une imagerie par bioluminescence pour évaluer l'effet curatif. Comme le montre la figure 7e, les signaux de bioluminescence ont progressivement diminué au fur et à mesure que le traitement progressait. Comme prévu, la tendance au changement des signaux de bioluminescence était cohérente avec la tendance au changement du nombre de bactéries après le traitement. Grâce à l'analyse quantitative, nous avons constaté que les signaux BLI dépendants de la concentration bactérienne étaient un indicateur important pour la détection et le traitement. Ces données thérapeutiques ont prouvé ensemble que la capacité antibactérienne adaptable de la stratégie développée in vivo.

a, b Homogénats de rein infecté chez des souris porteuses de néphrite traitées par PBS ou GP-Si-BP avec ou sans irradiation (avec irradiation au laser 808 nm, 1,0 W cm-2, 5 min) à 7 jours après l'injection cultivées sur la gélose LB solide (a) et quantification correspondante de la colonisation bactérienne (moyenne ± SD, n = 3 échantillons biologiquement indépendants) (b). c Images histologiques correspondantes de tissus rénaux infectés par S. aureus de souris avec différents traitements, comme indiqué. Barre d'échelle, 25 μm. d, Images photothermiques représentatives de souris porteuses de néphrite à S. aureus traitées avec du PBS ou des GP-Si-BP avec ou sans irradiation (avec irradiation d'un laser à 808 nm, 1,0 W cm-2, 5 min) à 7 jours après injection. e Imagerie par bioluminescence de souris porteuses de néphrite à S. aureus à différents moments de traitement à l'aide de sondes Trojan BLI et de la relation correspondante entre la variation de l'intensité de la bioluminescence au fil du temps et la variation du nombre de bactéries au fil du temps par comparaison quantitative. Après chaque irradiation, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de la même dose de GP-Si-Luc pour l'imagerie afin d'évaluer l'effet curatif (moyenne ± SD). Toutes les expériences d'imagerie ont été répétées trois fois avec des résultats similaires. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une analyse ANOVA unidirectionnelle. Les barres d'erreur représentent l'écart type obtenu à partir de trois mesures indépendantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

En fin de compte, nous avons systématiquement étudié la toxicité des GP-Si-BP et GP-Si-Luc. Comme le révèle la Fig. 25 supplémentaire, les morphologies des cellules HEK-293T, mREC, HeLa ou MCF-7 ont à peine changé lorsqu'elles ont été incubées avec GP-Si-BP + GP-Si-Luc (0, 06 mM). De plus, la viabilité cellulaire de ces cellules est restée supérieure à 80 % en utilisant les dosages de méthyl thiazolyl tétrazolium (MTT). Ces résultats suggèrent la faible cytotoxicité des GP-Si-BP et GP-Si-Luc. Nous avons utilisé la biochimie sanguine et l'analyse sanguine de routine pour tester la toxicité systématique des GP-Si-BP et GP-Si-Luc à la dose testée. Comme le montrent les tableaux supplémentaires 2 et 3, par rapport au groupe PBS, tous les indicateurs biochimiques du groupe GP-Si-BPs ou du groupe GP-Si-Luc se situaient dans la plage normale. De plus, nous avons également effectué une coloration H&E (Fig. 26a supplémentaire) et une coloration au trichrome de Masson (Fig. 26b supplémentaire) des principaux organes prélevés sur les souris après 1 jour d'injection intraveineuse de GP-Si-BP (0, 06 mM) ou GP-Si- Luc (0,06 mM). Ensemble, nous n'avons trouvé aucune anomalie histopathologique évidente dans les sections des organes réséqués, indiquant la toxicité in vivo négligeable des GP-Si-BP ou GP-Si-Luc. Comme cela a été révélé en outre dans l'imagerie par fluorescence ex vivo des principaux organes réséqués de souris saines après injection intraveineuse de GP-Si-BP (Fig. 27a supplémentaire), des signaux de fluorescence brillante ont été principalement observés dans le foie et les reins plutôt que dans d'autres organes à 2 h post- injection, et disparaîtrait totalement 48h post-injection. De plus, de forts signaux de fluorescence ont été observés dans les échantillons d'urine prélevés sur les souris saines après 24 h après l'injection de GP-Si-BP (Fig. 27b supplémentaire). Ces résultats suggèrent que les sondes construites pourraient être éliminées du corps.

Ici, nous avons développé une stratégie de cheval de Troie pour délivrer de manière sélective et robuste la luciférase et la luciférine dans diverses bactéries naturelles, visualisant la distribution bactérienne in vivo avec bioluminescence. La bioluminescence, en tant que modalité d'imagerie autoluminescente non invasive prometteuse, fait référence à l'émission de photons de l'oxydation exothermique de la luciférine correspondante catalysée par la luciférase18,19,20,21,22,23,24,25. Malgré les grandes perspectives de la bioluminescence, elle n'a guère permis l'imagerie des bactéries commensales et pathogènes en raison des limitations suivantes : (1) la bioluminescence endogène n'était produite que par certaines bactéries modifiées spécifiques et n'était pas applicable à la plupart des bactéries naturelles ; (2) la production de bioluminescence exogène a nécessité la participation d'ATP bactérien, qui a été obtenu par lyse bactérienne29,30,31,32,33,34. Un moyen plus simple de visualiser diverses bactéries naturelles in vivo avec la bioluminescence peut être de délivrer sélectivement un rapporteur bioluminescent dans les cellules bactériennes, en consommant directement l'ATP à l'intérieur des bactéries, tout en présentant des défis techniques en raison de la charge électrostatique ou des barrières de taille imposées par la membrane plasmique bactérienne unique. et paroi cellulaire. Curieusement, les stratégies antibiotiques cheval de Troie développées dans les années 1980 pourraient fournir des antibiotiques conjugués aux sidérophores dans le cytoplasme bactérien via les bactéries importatrices de fer35,36,37,38,39,40,41. Inspirés par cela, nous avons proposé la stratégie BLI du cheval de Troie.

Distingués des stratégies antibiotiques du cheval de Troie, dans notre conception, les indicateurs bioluminescents ont été chargés sur des SiNP modifiés par GP, transportés dans des bactéries via des transporteurs de sucre ABC. Il convient de noter que les SiNP, en tant que vecteurs, ont été largement utilisés dans diverses bioapplications en raison de leur toxicité faible/inexistante58,59,60,61,62,63,64. Comme indiqué précédemment, les SiNP pourraient être biodégradés et éliminés par voie rénale sans toxicité distincte in vivo65,66. Par exemple, les évaluations de la toxicité chez Caenorhabditis elegans, le ver à soie et même dans des modèles animaux primates non humains (par exemple, les macaques cynomolgus) ont démontré que les SiNP internalisés n'affecteraient pas la morphologie, la physiologie ou les fonctions immunitaires innées des animaux, suggérant une biocompatibilité bénigne de SiNPs dans les organismes vivants67,68,69. Sur cette base, les SiNP de petite taille ont reçu l'approbation d'un nouveau médicament expérimental approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) pour le premier essai clinique sur l'homme en janvier 2011 (c'est-à-dire NCT01266096, NCT02106598)70,71. En tant que tels, nous avons sélectionné les SiNP comme véhicules pour fournir des indicateurs bioluminescents. Les indicateurs bioluminescents comprenaient la luciférase et deux colorants organiques, Cy5 et ICG. En conséquence, l'émission NIR peut être obtenue à l'aide d'un processus de relais de transfert d'énergie à double résonance qui combine BRET entre la luciférase et Cy5, et FRET entre Cy5 et ICG. Ainsi, la stratégie développée a le potentiel d'imager les bactéries dans les tissus profonds dans des contextes cliniques spécifiques. Néanmoins, la combinaison de luciférase, Cy5 et ICG nécessite des travaux relativement compliqués pour la préparation des échantillons et l'analyse quantitative, ce qui réduit considérablement l'impact de ce travail. Dans l'étude suivante, nous testerons un système plus simple.

D'autre part, des recherches pionnières au cours des trois dernières décennies ont élucidé les mécanismes par lesquels la source de carbone unique des cellules bactériennes telles que les maltodextrines, l'amylose et l'amidon, ainsi que les cyclodextrines (1-4)-glucosidiquement liées pourraient être sélectivement internalisées. dans les cellules bactériennes par le transporteur de sucre ABC spécifique aux bactéries46,47,48,49,50,51,52,53. Cependant, ces connaissances n'ont pas abouti à des stratégies basées sur le transporteur ABC qui réussissent à livrer une cargaison bioluminescente dans les cellules bactériennes. Pour combler cette lacune, nous avons tiré parti des transporteurs de sucre ABC spécifiques aux bactéries pour internaliser sélectivement la luciférase et la luciférine en les faisant de l'auto-stop sur des molécules GP avec un équivalent de dextrose de 4,0 ~ 7,0. Les sondes Trojan BLI synthétisées ont été sélectivement internalisées dans les bactéries Gram-positives (par exemple, S. aureus, SARM d'origine clinique) et les bactéries Gram-négatives (par exemple, STm, E. coli MDR d'origine clinique) avec un taux d'absorption élevé jusqu'à à 50 %. Nous avons montré sa capacité dans l'imagerie ex vivo de l'endophtalmie bactérienne chez l'homme. Nous avons montré son image sélective contre la néphrite bactérienne et la colite bactérienne chez la souris par rapport à d'autres types de néphrite et de colite chez la souris. Par ailleurs, nous avons démontré que la stratégie développée permettait la destruction photothermique de près de 95% des bactéries résistantes aux antibiotiques in vitro et in vivo. Nous prévoyons que la stratégie Trojan BLI proposée pourrait catalyser l'administration de diverses substances dans les cellules bactériennes, permettant le développement de diverses approches d'imagerie ou thérapeutiques, l'imagerie par bioluminescence des bactéries rapportée dans ce travail servant de première preuve de principe.

Le protocole de recherche utilisant des échantillons de sang humain a été approuvé par le comité d'éthique de l'Université de Soochow. Les échantillons ont été fournis après consentement éclairé écrit. Les auteurs déclarent que toutes les expériences sur le sang humain ont été menées en stricte conformité avec les lois en vigueur et les directives institutionnelles. Les échantillons cliniques ont été fournis par la Banque des yeux de l'hôpital des yeux, des oreilles, du nez et de la gorge de l'Université de Fudan avec l'approbation du comité d'éthique de l'hôpital (EENTIRB-2017-06-07-01). Toutes les expériences ont été menées conformément à la Déclaration d'Helsinki et en conformité avec la loi chinoise.

Après une irradiation de 7 jours et 365 nm à température ambiante sur le mélange de C6H17NO3Si et de 1,8-naphtalimide, les SiNP fluorescents de petite taille ont été préparés. Ensuite, la solution résultante a été purifiée par centrifugation à 3381 x g pendant 15 min et dialyse (MWCO, 1000, Spectra/Pro) pour éliminer les réactifs n'ayant pas réagi. Les produits finaux des SiNPs ont été collectés par évaporation et stockés à 4 oC pour les expériences suivantes. Pour obtenir des SiNPs modifiés par GP (GP-SiNPs), le mélange de solution de SiNPs (200 μL, 0,08 mM) et de solution de GP (100 μL, 0,56 mM) a été agité en continu à 70 ° C pendant 6 h, suivi de l'ajout de 0,01 mg de NaBH4 pour faire réagir encore 12 h à température ambiante. La solution résultante a été purifiée par des dispositifs centrifuges Nanosep (coupure MW, 3 kDa; Millipore) par centrifugation à 5283 x g pendant 15 min pour éliminer les molécules de GP n'ayant pas réagi. Pour charger davantage les molécules Cy5 et ICG, une solution Cy5 (2 μL, 0, 56 mM) et une solution ICG (12 μL, 0, 56 mM) ont été ajoutées à la solution GP-SiNPs préparée ci-dessus et agitées à température ambiante pendant une nuit. De même, la solution résultante a été purifiée par des dispositifs centrifuges Nanosep (coupure MW, 3 kDa; Millipore) par centrifugation à 6010 x g pendant 10 min pour éliminer les molécules Cy5 et ICG déchargées. Ensuite, une solution de luciférase contenant de l'amine (0,1 ml, 0,06 mM), une solution d'EDC (2 μL, 10 mM) et une solution de NHS (10 μL, 17 mM) ont été ajoutées à la solution préparée ci-dessus pour une réaction pendant la nuit à température ambiante pour obtenir des GP-Si-BP. De plus, la solution résultante a été purifiée par des dispositifs centrifuges Nanosep (coupure MW, 100 kDa; Millipore) par centrifugation à 5283 x g pendant 15 min. De manière analogue, GP-Si-Luc a également été synthétisé par l'ajout de D-luciférine (0,1 mL, 0,30 mM), de solution EDC (2 μL, 10 mM) et de solution NHS (10 μL, 17 mM) à la solution GP-SiNPs sur nuit à température ambiante suivi du protocole purifié identique.

La morphologie et la taille des sondes Trojan BLI ont été caractérisées en utilisant une microscopie électronique à transmission (TEM, Philips CM 200) avec 200 kV. Les spectres d'absorption UV-vis des sondes Trojan BLI ont été enregistrés à l'aide d'un spectrophotomètre proche infrarouge 750 UV-vis (Perkin-Elmer lambda). Les spectres de photoluminescence des sondes Trojan BLI ont été enregistrés à l'aide d'un spectro-fluorimètre (HORIBA JOBIN YVON FLUORMAX-4). Les spectres de bioluminescence des sondes Trojan BLI ont été enregistrés à l'aide d'un instrument HITACHI Fluorescence Spectrometer F-4700. La diffusion dynamique de la lumière (DLS) et les potentiels Zeta des sondes Trojan BLI ont été mesurés à l'aide d'un analyseur de particules Delsa™ nano de taille submicronique et de potentiel Zeta (Beckman Coulter, Inc). L'imagerie de fluorescence des bactéries in vitro a été réalisée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (CLSM, Leica, TCS-SP5 II). Des images de fluorescence et de bioluminescence ex vivo et in vivo ont été obtenues par un système d'imagerie optique in vivo (IVIS Lumina III). Les signaux luminescents des GP-Si-BP dans différentes solutions ont été examinés à l'aide d'un système d'imagerie IVIS Lumina III. A cette fin, GP-Si-BPs à 0,06 mM a été mélangé avec de l'ATP à différentes concentrations dans une plaque noire à 96 puits. Après un mélange minutieux, la plaque a été immédiatement placée dans le système d'imagerie pour acquérir des signaux luminescents. De même, la luminescence atténuée des GP-Si-BP a été quantifiée après incubation avec un inhibiteur de l'ATP, DCC, en présence de GP-Si-Luc.

Staphylococcus aureus multirésistant d'origine clinique (SARM) et Escherichia coli multirésistant (MDR E. coli) ont été isolés chez des patients atteints de kératite et ont été fournis par la Banque des yeux de l'hôpital des yeux, des oreilles, du nez et de la gorge, Université de Fudan, sous l'approbation du comité d'éthique hospitalier (EENTIRB-2017-06-07-01). Escherichia coli (ATCC 11303) et Staphylococcus aureus ont été achetés auprès de l'American type culture collection (ATCC). Micrococcus luteus (BNCC 102589), Pseudomonas aeruginosa (BNCC 125486) et Salmonella typhimurium (BNCC 108207) ont été achetés auprès de BeNa Culture Collection (BNCC, Shanghai, Chine). Le milieu LB a été acheté auprès de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Pour cultiver les bactéries, nous avons d'abord dissous la poudre lyophilisée de souches dans le milieu liquide LB, puis nous avons enduit le liquide bactérien sur le milieu de la plaque LB et les avons cultivées dans le milieu. incubateur à 37 oC pendant 12 h. Après cela, nous avons prélevé une seule colonie de la plaque et l'avons cultivée dans le milieu liquide LB dans l'incubateur à 250 tr/min et 37 oC. Nous avons collecté les cellules bactériennes en phase de croissance exponentielle. La concentration de bactéries a été détectée en mesurant la densité optique (DO) à 600 nm. Le nombre de colonies bactériennes a été compté par un instrument de comptage de colonies (Czone 8). Les expériences ont été menées conformément à la Déclaration d'Helsinki et dans le respect de la loi chinoise.

Les 20 µL de suspension bactérienne purifiée et remise en suspension (1,0 × 107 UFC) ont été incubés avec GP-Si-BPs (0,06 mM, 200 µL), GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL), GP-Si- BP (0,06 mM, 200 µL) + GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL), Si-BP (0,06 mM, 200 µL), Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) et Si-BP (0,06 mM , 200 µL) + Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) pendant 2,5 h dans un incubateur à agitation (250 tr/min) à 37 oC. Les bactéries ont été récoltées en centrifugeant le mélange à 3381 x g pendant 5 min dans des tubes Eppendorf (EP). Les bactéries résultantes ont été remises en suspension et lavées trois fois avec du PBS. Ensuite, 10 µL de la solution bactérienne lavée ont été transférés sur une lame de microscope recouverte d'une lamelle, puis imagés par un microscope confocal à balayage laser (CLSM, Leica, TCSSP5 II) avec une puissance de 30 % du laser à diode. Toutes les images de fluorescence ont été capturées par CLSM avec un objectif à immersion dans l'huile × 64 et prises dans les mêmes conditions optiques, et la même luminosité et le même contraste ont été automatiquement appliqués aux images par le microscope. Le traitement et l'analyse du retour sur investissement ont été effectués par le logiciel commercial d'analyse d'images (Leica Application Suite Advanced Fluorescence Lite). De plus, l'apparition de GP-Si-BP dans les cellules bactériennes a été confirmée par TEM (Philips CM 200).

Toutes les procédures expérimentales animales ont été réalisées selon le protocole approuvé par le comité de protection des animaux de l'Université de Soochow. Les conditions de logement pour les souris étaient de 25 ° C et 65% d'humidité ajustée par l'équipement de ventilation et le système de filtration de l'air. Pour construire la colite induite par STm chez la souris, des souris nude femelles (grade SPF, âgées de 6 à 8 semaines) ont été traitées avec 100 μL de solution de streptomycine (200 mg mL-1) avant l'administration orale de STm. Au deuxième jour après l'infection, les souris ont reçu une injection intraveineuse de GP-Si-BP ou de Si-BP (0,06 mM, 200 µL). À 6 h post-injection de sondes, les souris traitées ont reçu une injection intrapéritonéale de GP-Si-Luc ou Si-Luc (0,06 mM, 200 µL), suivi de BLI en utilisant un système d'imagerie optique in vivo (IVIS Lumina III, exposition temps = 5 min, f/stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) à 15 min post-injection de substrats. A titre de comparaison, les souris infectées ont reçu une injection intrapéritonéale de luminol (282 mM, 200 μL), suivi de BLI en utilisant un système d'imagerie optique in vivo (IVIS Lumina III, temps d'exposition = 5 min, f/stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) à 10 min post-injection. Nous avons utilisé la récolte, l'homogénéisation et la culture des tissus intestinaux avec le nombre d'UFC pour déterminer le nombre réel de bactéries sur les sites d'infection lors de l'imagerie. La concentration réelle de STm au site d'infection pendant l'imagerie était d'environ 1,0 × 109 UFC. Pour tester la sélectivité de la stratégie proposée, nous avons construit une colite induite par le DSS chez la souris (femelle, âgée de 6 à 8 semaines, n = 3). Les souris porteuses de colite DSS ont été traitées avec GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) ou luminol (282 mM, 200 µL) pour l'imagerie par luminescence (IVIS Lumina III, temps d'exposition = 5 min, f/stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) de la même manière que les souris porteuses de colite STm mentionnées ci-dessus. Pour construire la néphrite induite par S. aureus chez la souris, 25 μL de S. aureus ont été injectés in situ dans le rein des souris nude (femelle, âgée de 6 à 8 semaines, n = 3). 12 h après l'injection, les souris infectées ont reçu une injection intraveineuse de 200 μL de GP-Si-BP ou Si-BP 0, 06 mM. Six heures plus tard, ces souris ont reçu une injection intrapéritonéale de GP-Si-Luc ou Si-Luc (0,06 mM, 200 μL), suivie d'une imagerie in vivo à l'aide d'un système d'imagerie optique (IVIS Lumina III, temps d'exposition = 5 min, f /stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) à 15 min post-injection. La concentration réelle de S. aureus au site d'infection pendant l'imagerie était d'environ 1,0 × 108 UFC, qui a été déterminée par la récolte, l'homogénéisation et la culture des tissus rénaux avec le nombre d'UFC comme mentionné ci-dessus. De plus, pour tester la sélectivité de la stratégie proposée contre la néphrite bactérienne par rapport à d'autres néphrites, nous avons construit une néphrite causée par la glycérine chez la souris (femelle, âgée de 6 à 8 semaines, n = 3). Les souris porteuses de néphrite à glycérine ont été traitées avec GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) ou luminol (282 mM, 200 µL) pour l'imagerie par luminescence (IVIS Lumina III, temps d'exposition = 5 min, f/stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) de la même manière que les souris porteuses de néphrite DSS mentionnées ci-dessus.

S. aureus ou E. coli ont été respectivement incubés avec du PBS ou des GP-Si-BP, suivis de l'irradiation d'un laser à 808 nm (laser à 808 nm : 1,0 W cm-2, 5 min). La morphologie des bactéries après traitement a été caractérisée par MEB (FEI Quanta 200 F). S. aureus, E. coli, M. luteus, P. aeruginosa, MRSA et MDR E. coli ont été respectivement traités avec du PBS, des SiNP, des Si-BP et des GP-Si-BP suivis de l'irradiation au laser 808 nm (808 -nm, 1,0 W cm-2, 5 min). Le taux antibactérien in vitro a été obtenu sur la base des colonies de bactéries sur les plaques de gélose. Le taux antibactérien a été calculé selon l'Eq. (1):

où "Ncontrol" et "Nexperiment" représentent le nombre de bactéries (CFU mL-1) dans les groupes témoins de "PBS" et d'autres groupes expérimentaux (expérience), respectivement.

Nous avons utilisé la néphrite induite par S. aureus chez la souris pour évaluer la capacité antibactérienne de la stratégie développée in vivo. Pour construire le modèle, S. aureus (25 μL, ~ 1, 1 × 106 UFC) a été injecté in situ dans le rein gauche des souris (femelle, âgée de 6 à 8 semaines, n = 3). Six heures après l'injection, ces souris ont reçu une injection intraveineuse de 200 μL de tampon GP-Si-BP ou PBS 0, 06 mM les jours 1, 3, 5 et 7 respectivement. Six heures après chaque injection de médicament, les sites infectés ont été irradiés avec ou sans laser à 808 nm (1,0 W cm-2, 5 min). Après la thérapie photothermique, les problèmes rénaux infectés ont été extraits, suivis d'une homogénéisation et d'une culture des homogénats sur des plaques. Le taux antibactérien correspondant a été calculé sur la base de l'Eq. (1). Pendant ce temps, les tissus rénaux infectés après les traitements ont été fixés dans la solution de PFA à 4 % pour la coloration H&E suivante.

Cellules T 293 de rein embryonnaire humain (cellules HEK-293T), cellules cervicales humaines (cellules HeLa), cellules cancéreuses du sein humaines (cellules MCF-7) et cellules endothéliales rétiniennes de souris (cellules mREC), cultivées dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco à haute glucose (H-DMEM), ont été achetés auprès de Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd (Chine). Tous les milieux mentionnés ci-dessus ont été additionnés de 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS) et de 1 % d'antibiotiques pertinents (100 μg mL-1 de streptomycine et 100 U mL-1 de pénicilline). Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 avec une atmosphère humidifiée.

Des échantillons de sang humain ont été fournis par un volontaire sain après consentement éclairé écrit. Les protocoles d'étude utilisant des échantillons de sang humain ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Soochow. Les auteurs déclarent que toutes les expériences sur le sang humain ont été réalisées en stricte conformité avec les lois pertinentes et les directives institutionnelles. Dix patients atteints d'endophtalmie bactérienne subissant une chirurgie du vitré, des échantillons de liquide vitré non dilué non contaminé (0,1 ml) ont été prélevés dans une seringue avec une aiguille de 30 G au cours d'une vitrectomie diagnostique par la pars plana (PPV). Immédiatement après le prélèvement, l'échantillon a été transféré dans un tube de microcentrifugeuse pré-stérilisé et utilisé pour l'imagerie. Ces échantillons cliniques ont également été fournis par la Banque des yeux de l'hôpital des yeux, des oreilles, du nez et de la gorge de l'Université de Fudan, sous l'approbation du comité d'éthique de l'hôpital (EENTIRB-2017-06-07-01).

Pour les tests de signification statistique, nous avons utilisé une analyse ANOVA unidirectionnelle ou le test t bilatéral apparié. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant le logiciel Origin ou GraphPad Prism. Les barres d'erreur représentent l'écart type obtenu à partir de trois mesures indépendantes. La région d'intérêt (ROI) a été utilisée pour les évaluations quantitatives de l'intensité de fluorescence, qui a été calculée par le logiciel d'analyse d'image commercial (Leica Application Suite Advanced Fluorescence Lite 2. 6. 0, LAS AF Lite 2. 6. 0).

La taille des groupes pour les expériences a été choisie sur la base de l'expérience antérieure et de la préséance de la littérature, de sorte qu'un nombre suffisant a été utilisé pour assurer la reproductibilité et déterminer les écarts-types. Le nombre d'animaux était d'au moins 3. Pour chaque échantillon, deux répétitions techniques ont été réalisées. S'il y avait une variation de 20 % ou plus entre les répétitions techniques, deux répétitions techniques supplémentaires ont été effectuées. Toutes les expériences ont été réalisées avec au moins 3 échantillons répétés pour chaque groupe expérimental, et nous avons confirmé que toutes les tentatives de réplication ont réussi. Aucune donnée n'a été exclue des analyses. Les échantillons ont été répartis en groupes expérimentaux au hasard. Toutes les collectes et analyses de données ont été réalisées en aveugle avec des échantillons randomisés.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données qui appuient les conclusions de cette étude sont disponibles dans le document et ses informations supplémentaires. Les données sources sont fournies avec ce document.

Hou, X. et al. Les nanoparticules de lipides vitaminiques permettent le transfert adoptif de macrophages pour le traitement de la septicémie bactérienne multirésistante. Nat. Nanotechnologie. 15, 41–46 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, CY et al. Le gel de carbomère incrusté de particules d'argent à l'échelle de l'Ångstrom favorise la cicatrisation des plaies en inhibant la colonisation bactérienne et l'inflammation. Sci. Adv. 6, eaba0942 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bar-Zion, A. et al. Mécanothérapie à déclenchement acoustique utilisant des vésicules de gaz génétiquement codées. Nat. Nanotechnologie. 16, 1403–1412 (2021).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Rodriguez-Pagan, I., Novick, RP, Ross, HF, Jiang, D. & Ram, G. Conversion des îlots de pathogénicité staphylococcique en agents antibactériens porteurs de CRISPR qui guérissent les infections chez la souris. Nat. Biotechnol. 36, 971–976 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lopez-Igual, R. et al. Les antimicrobiens toxine-intéine fabriqués peuvent cibler et tuer de manière sélective les bactéries résistantes aux antibiotiques dans des populations mixtes. Nat. Biotechnol. 37, 755–760 (2019).

Article PubMed Google Scholar

Akin, D. et al. Livraison médiée par les bactéries de nanoparticules et de cargaison dans les cellules. Nat. Nanotechnologie. 2, 441–449 (2007).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Sun, D. et al. La nanozyme commutable par ultrasons augmente la thérapie sonodynamique contre les infections bactériennes multirésistantes. ACS Nano 14, 2063–2076 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, Y. et al. Détection IRM ciblée in situ de Helicobacter pylori avec des nanocapsules graphitiques magnétiques stables. Nat. Commun. 8, 15653 (2017).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zlitni, A. et al. Sondes à base de maltotriose pour la fluorescence et l'imagerie photoacoustique des infections bactériennes. Nat. Commun. 11, 1250 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zeng, J. et al. Plate-forme intelligente guidée par imagerie de bio-assemblage pour la stérilisation bactérienne en temps réel et la thérapie infectieuse. Nano Rés. 15, 4164–4174 (2022).

Article ADS CAS Google Scholar

Qing, G. et al. Nanotransporteur triple fonction thermo-sensible pour une thérapie chimio-photothermique efficace des infections bactériennes multirésistantes. Nat. Commun. 10, 4336 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yan, LX, Chen, LJ, Zhao, X. & Yan, XP Nanoplateforme à pH commutable pour l'imagerie par luminescence persistante in vivo et la thérapie photothermique précise des infections bactériennes. Adv. Fonct. Mater. 30, 1909042 (2020).

Article CAS Google Scholar

Van Oosten, M. et al. Imagerie in vivo en temps réel d'infections bactériennes invasives et associées à des biomatériaux à l'aide de vancomycine marquée par fluorescence. Nat. Commun. 4, 2584 (2013).

Article ADS PubMed Google Scholar

Zhang, X. et al. Nanoparticules de silicium quaternisées avec fluorescence sensible à la polarité pour l'imagerie sélective et la destruction des bactéries gram-positives. Adv. Fonct. Mater. 26, 5958–5970 (2016).

Article CAS Google Scholar

Wang, S. et al. Fluorophores moléculaires NIR-II anti-extinction pour l'imagerie in vivo à contraste élevé et la détection du pH. Nat. Commun. 10, 1058 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiong, L., Shuhendler, AJ & Rao, J. Points proche infrarouge BRET-FRET autoluminescents pour la cartographie in vivo des ganglions lymphatiques et l'imagerie tumorale. Nat. Commun. 3, 1193 (2012).

Article ADS PubMed Google Scholar

Ainsi, MK, Xu, C., Loening, AM, Gambhir, SS & Rao, J. Conjugués de points quantiques auto-éclairants pour l'imagerie in vivo. Nat. Biotechnol. 24, 339-343 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Su, Y. et al. De nouveaux substrats nanoLuc permettent une imagerie lumineuse par bioluminescence à deux populations chez les animaux. Nat. Méthodes 17, 852–860 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lu, L. et al. Bioluminescence NIR-II pour l'imagerie à contraste élevé in vivo et le traçage in situ des métastases médiées par l'ATP. Nat. Commun. 11, 4192 (2020).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maric, T. et al. Imagerie bioluminescente et quantification de l'absorption de glucose in vivo. Nat. Méthodes 16, 526–532 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iwano, S. et al. Imagerie par bioluminescence unicellulaire des tissus profonds chez des animaux en mouvement libre. Sciences 359, 935–939 (2018).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Yevtodiyenko, A. et al. Plateforme bioluminescente portable pour le suivi in ​​vivo des processus biologiques chez les animaux non transgéniques. Nat. Commun. 12, 2680 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chu, J. et al. Une protéine fluorescente orange cyan-excitable lumineuse facilite la microscopie à double émission et améliore l'imagerie par bioluminescence in vivo. Nat. Biotechnol. 34, 760 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oui, HW et al. Paires luciférase-luciférine décalées vers le rouge pour une meilleure imagerie par bioluminescence. Nat. Méthodes 14, 971 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oh, Y. et al. Un indicateur bioluminescent orange modulé en calcium pour l'imagerie d'activité non invasive. Nat. Chim. Biol. 15, 433–436 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiang, YY & Pu, K. Sondes moléculaires pour l'imagerie optique sans autofluorescence. Chim. Rév. 21, 13086–13131 (2021).

Article Google Scholar

Xu, C. et al. Nanoparticules avec luminescence post-luminescente induite par les ultrasons pour les théranostiques spécifiques aux tumeurs. Nat. Biomédical. Ing. 7, 298-312 (2023).

Article CAS PubMed Google Scholar

He, S., Cheng, P. & Pu, K. Sondes proche infrarouge activables pour la détection de populations spécifiques de leucocytes infiltrant les tumeurs in vivo et dans l'urine. Nat. Biomédical. Ing. 7, 281–297 (2023).

Article CAS PubMed Google Scholar

Khodakivskyi, PV et al. Imagerie non invasive et quantification de l'activité hydrolase des sels biliaires : des bactéries à l'homme. Sci. Adv. 7, eaaz9857 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Min, JJ et al. Imagerie bioluminescente quantitative des bactéries ciblant les tumeurs chez les animaux vivants. Nat. Protocole 3, 629–636 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Yu, YA et al. Visualisation de tumeurs et de métastases chez des animaux vivants avec des bactéries et le virus de la vaccine codant pour des protéines émettrices de lumière. Nat. Biotechnol. 22, 313-320 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Min, JJ et al. Imagerie non invasive en temps réel des tumeurs et des métastases à l'aide d'Escherichia coli émettant de la lumière ciblant la tumeur. Mol. Imagerie Biol. 10, 54–61 (2008).

Article PubMed Google Scholar

Klose, AD & Paragas, N. Quantification automatisée des images de bioluminescence. Nat. Commun. 9, 4262 (2018).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seong, Royaume-Uni et al. Détection de bactéries basée sur la bioluminescence de l'adénosine triphosphate à l'aide d'une lyse photothermique ciblée par des nanobâtonnets d'or. Anal. Chim. 90, 10171–10178 (2018).

Article Google Scholar

Bergeron, RJ Synthèse et structure en solution des sidérophores microbiens. Chim. Rev.84, 587–602 (1984).

Article CAS Google Scholar

Han, S. et al. Base structurelle de l'efficacité des monocarbames conjugués aux sidérophores contre les souches cliniquement pertinentes de Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 107, 22002–22007 (2010).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lemire, J., Harrison, J. & Turner, R. Activité antimicrobienne des métaux : mécanismes, cibles moléculaires et applications. Nat. Rév. Microbiol. 11, 371–384 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Brown, E. & Wright, G. Découverte de médicaments antibactériens à l'ère de la résistance. Nature 529, 336–343 (2016).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Masi, M. et al. Mécanismes de perméabilité de l'enveloppe et influx et efflux d'antibiotiques chez les bactéries Gram-négatives. Nat. Microbiol. 2, 17001 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Chakradhar, S. Percée : comment les chercheurs pénètrent dans les bactéries barricadées. Nat. Méd. 23, 907–910 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Raffatellu, M. Apprendre de la compétition bactérienne chez l'hôte pour développer des antimicrobiens. Nat. Méd. 24, 1097-1103 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tang, J. et al. Nanoagents multifonctionnels pour l'imagerie ultrasensible et la destruction photoactive des bactéries Gram-négatives et Gram-positives. Nat. Commun. 10, 4057 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, Y. et al. Les bactéries mangent des nanosondes pour une imagerie améliorée par agrégation et tuant divers micro-organismes. Nat. Commun. 13, 1255 (2022).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chu, B. et al. Système de nanobactéries troyennes pour la destruction programmable photothermique des tissus tumoraux profonds. Angew. Chim. Int. Éd. 61, e202208422 (2022).

Article CAS Google Scholar

Sun, R. et al. Bactéries chargées de polymère de glucose et de nanoparticules de silicium ICG photosensibles pour l'immunothérapie photothermique du glioblastome. Nat. Commun. 13, 5127 (2022).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ning, X. et al. Imagerie TEP d'infections bactériennes avec du maltohexaose marqué au fluor-18. Angew. Chim. Int. Éd. 53, 14096–14101 (2014).

Article CAS Google Scholar

Bordignon, E., Grote, M. & Schneider, E. Le transporteur de cassettes de liaison à l'ATP du maltose au 21e siècle - vers une perspective dynamique structurelle sur son mode d'action. Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Shuman, HA Le système de transport maltose-maltodextrine d'Escherichia coli. Ann. Microbiol. 133A, 153–159 (1982).

CAS Google Scholar

Klebba, PE Mécanisme de transport de la maltodextrine à travers LamB. Rés. Microbiol. 153, 417-424 (2002).

Article CAS PubMed Google Scholar

Boos, W. & Shuman, H. Système maltose/maltodextrine d'Escherichia coli : transport, métabolisme et régulation. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 204–229 (1998).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Freundlieb, S., Ehmann, U. & Boos, W. Diffusion facilitée du p-nitrophényl-alpha-D-maltohexaoside à travers la membrane externe d'Escherichia coli. Caractérisation de LamB comme canal spécifique et saturable des malto-oligosaccharides. J. Biol. Chim. 263, 314–320 (1988).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gopal, S. et al. L'utilisation du maltose et de la maltodextrine par Listeria monocytogenes dépend d'un transporteur ABC inductible qui est réprimé par le glucose. PLoS One 5, e10349 (2010).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morbach, S., Tebbe, S. & Schneider, E. Le transporteur de cassette de liaison à l'ATP (ABC) pour le maltose/maltodextrines de Salmonella typhimurium. Caractérisation de l'activité ATPase associée à la sous-unité Malk purifiée. J. Biol. Chim. 268, 18617–18621 (1993).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ji, XY et al. Nanoporteurs de médicaments en silicium hautement fluorescents, photostables et ultrapetits pour le suivi à long terme des cellules tumorales et le traitement in vivo du cancer. Adv. Mater. 27, 1029-1034 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wu, SC et al. Préparation biomimétique et bioimagerie bicolore de nanoparticules de silicium fluorescentes. Confiture. Chim. Soc. 137, 14726–14732 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Li, H. et al. Synthèse micro-ondes en un seul pot de nanoparticules de silicium à haute fluorescence dispersibles dans l'eau et leurs applications d'imagerie in vitro et in vivo. Confiture. Chim. Soc. 133, 14192 (2011).

Article Google Scholar

Ning, X. et al. Les sondes d'imagerie à base de maltodextrine détectent les bactéries in vivo avec une sensibilité et une spécificité élevées. Nat. Mater. 10, 602–607 (2011).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Charbit, A. Transport de la maltodextrine par LamB. Devant. Biosci. 8, 265-274 (2003).

Article Google Scholar

Gross, S. et al. Imagerie par bioluminescence de l'activité de la myéloperoxydase in vivo. Nat. Méd. 15, 455–461 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, X. et al. Une nanoparticule auto-éclairante pour l'imagerie de l'inflammation et le traitement du cancer. Sci. Adv. 5, eaat2953 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji, X. et al. Nanoporteurs de médicaments en silicium hautement fluorescents, photostables et ultrapetits pour le suivi à long terme des cellules tumorales et le traitement in vivo du cancer. Adv. Mater. 27, 1029-1034 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Song, B. & He, Y. Nanomatériaux de silicium fluorescents : de la synthèse à la fonctionnalisation et à l'application. Nano Today 26, 149-163 (2019).

Article CAS Google Scholar

Su, Y., Ji, X. & He, Y. Nanoparticules de silicium fluorescentes dispersibles dans l'eau et leurs applications optiques. Adv. Mater. 28, 10567–10574 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Peng, F. et al. Plateforme de nanomatériaux de silicium pour la bioimagerie, la biodétection et le traitement du cancer. Acc. Chim. Rés. 47, 612–623 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Park, JH et al. Nanoparticules de silicium poreux luminescents biodégradables pour applications in vivo. Nat. Mater. 8, 331–336 (2009).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gu, L. et al. Imagerie de fluorescence temporisée in vivo avec des nanoparticules de silicium poreux luminescents biodégradables. Nat. Commun. 4, 2326 (2013).

Article ADS PubMed Google Scholar

Xing, R. et al. Impact des nanoparticules de silicium fluorescentes sur l'hémolymphe et l'hématopoïèse circulantes chez un organisme modèle invertébré. Chemosphere 159, 628–637 (2016).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Zhou, Y. et al. L'imagerie moléculaire ciblée in vivo de nanoparticules de silicium fluorescentes chez Caenorhabditiselegans. Nano Rés. 11, 2336-2346 (2017).

Article Google Scholar

Tang, M. et al. Angiographie par fluorescence du fond d'œil à long terme et diagnostic en temps réel des maladies rétiniennes dans des modèles primate-animal non humains. Nano Rés. 14, 3840–3847 (2021).

Article ADS CAS Google Scholar

Phillips, E. et al. Traduction clinique d'une sonde de nanoparticules d'imagerie TEP optique inorganique ultra-petite. Sci. Trans. Méd. 6, 260ra149 (2014).

Article Google Scholar

Benezra, M. et al. Les nanoparticules de silice multimodales sont des sondes efficaces ciblées contre le cancer dans un modèle de mélanome humain. J.Clin. Investir. 121, 2768-2780 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Nous remercions le professeur Shuit-Tong Lee (Soochow University, Chine), le professeur Chunhai Fan (Shanghai Jiao Tong University, Chine) et le Dr Fei Peng (Harvard University, USA) pour leur aide générale et leurs précieuses suggestions. YH divulgue le soutien à la recherche décrite dans cette étude de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [numéro de subvention 21825402], Programme pour les professeurs spécialement nommés du Jiangsu au professeur Yao He, un projet financé par le développement du programme académique prioritaire des établissements d'enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD ), Projet 111 et Centre d'innovation collaborative de Suzhou Nano Science and Technology (NANO-CIC). HYW divulgue un soutien pour la recherche décrite dans cette étude de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [numéro de subvention 22074101] et de la Fondation des sciences naturelles de la province chinoise du Jiangsu [numéro de subvention BK20191417]. JXH divulgue le soutien à la recherche décrite dans cette étude de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [numéro de subvention 81970766, 82171102], le programme de développement de l'innovation de Shanghai [numéro de subvention 2020-RGZN-02033] et le programme de recherche clinique clé de Shanghai [numéro de subvention SHDC2020CR3052B ]. BS divulgue un soutien pour la recherche décrite dans cette étude de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [numéro de subvention 22204116] et de la Fondation des sciences naturelles de la province chinoise du Jiangsu [numéro de subvention BK20200851]. La BBC divulgue le soutien à la recherche décrite dans cette étude de la National Natural Science Foundation of China [numéro de subvention 22204117] et de la China Postdoctoral Science Foundation [numéro de subvention 2021M692347].

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Qian Zhang, Bin Song, Yanan Xu.

Suzhou Key Laboratory of Nanotechnology and Biomedicine, Institute of Functional Nano & Soft Materials & Collaborative Innovation Center of Suzhou Nano Science and Technology (NANO-CIC), Soochow University, Suzhou, 215123, Chine

Qian Zhang, Bin Song, Yanan Xu, Yunmin Yang, Jianping Lu, Jiali Ding, Haiting Cao, Binbin Chu, Houyu Wang et Yao He

Département d'ophtalmologie et des sciences de la vision, Hôpital des yeux, des oreilles, du nez et de la gorge de Shanghai, Université Fudan, Shanghai, Chine

Jian Ji, Wenjun Cao et Jiaxu Hong

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QZ, BS, JXH, YNX, YMY, HYW et YH ont conçu et conçu la recherche. QZ et BS ont réalisé la plupart des expériences et analysé les données. YMY, JJ, WJC, JPL, JLD, HTC et BBC ont effectué des expériences et des caractérisations supplémentaires. QZ, YNX, JXH, HYW et YH ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Jiaxu Hong, Houyu Wang ou Yao He.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les autres évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Zhang, Q., Song, B., Xu, Y. et al. Imagerie par bioluminescence in vivo de bactéries naturelles dans les tissus profonds via un transporteur de sucre à cassette de liaison à l'ATP. Nat Commun 14, 2331 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37827-9

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Reçu : 27 octobre 2022

Accepté : 03 avril 2023

Publié: 22 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37827-9

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