Incorporation coplanaire de plusieurs modèles de cellules 3D dans un hydrogel vers une haute

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 9991 (2022) Citer cet article

2090 accès

1 Citations

7 Altmétrique

Détails des métriques

Des méthodes standardisées et à haut débit ont été développées pour la production et la manipulation expérimentale de certains modèles 3D in vitro. Cependant, les scientifiques et les chercheurs manquent toujours d'outils analytiques adaptés pour exploiter pleinement le potentiel des modèles cellulaires complexes dans les tests précliniques de médicaments et la médecine de précision. L'histologie est la méthode établie, rentable et de référence pour l'analyse structurelle et fonctionnelle des tissus. Cependant, les processus histologiques standard sont difficiles et coûteux à appliquer aux modèles cellulaires 3D, car leur petite taille conduit souvent à un mauvais alignement des échantillons, ce qui réduit le débit d'analyse. Cet ensemble de travaux propose une nouvelle approche : HistoBrick facilite le traitement histologique des sphéroïdes et des organoïdes en permettant l'enrobage de gel de modèles cellulaires 3D avec un alignement coplanaire précis, parallèle au plan de coupe, minimisant ainsi la perte de matériau d'échantillon. Les fonctionnalités d'HistoBrick sont compatibles avec les normes d'automatisation, permettant potentiellement le transfert automatisé d'échantillons d'une plaque multipuits au dispositif de gel. De plus, la technologie d'HistoBrick a été validée en démontrant l'alignement de sphéroïdes cultivés HepG2 mesurant 150 à 200 µm de diamètre avec une précision de hauteur de ± 80 µm. HistoBrick permet d'étudier jusqu'à 96 échantillons sur des sections minimales, ouvrant la voie à une micro-histologie à haut débit.

Les modèles cellulaires tridimensionnels (3D) in vitro gagnent du terrain, car ils permettent de meilleures fonctions, architectures et interfaces tissulaires physiologiquement pertinentes par rapport aux cultures bidimensionnelles (2D). Les modèles in vitro complexes dérivés du patient reflètent la constitution génétique unique. De plus, les omiques et l'analyse de dépistage de drogue sont grandement facilitées par rapport aux expériences sur les animaux1. Dans ce contexte, des modèles complexes in vitro tels que les sphéroïdes, les organoïdes ou les tumoroïdes (collectivement appelés micro-tissus), sont largement utilisés pour la modélisation de maladies, le développement préclinique de médicaments et l'ingénierie tissulaire2. Les micro-tissus soutiennent ainsi la mise en place d'une médecine personnalisée3. Les modèles cellulaires 3D complexes4 ont été principalement utilisés pour élucider les aspects de la biologie cellulaire5, tandis que le développement d'outils et de méthodologies standardisées pour la production, le tri, le placement, la maturation et l'analyse a suivi. En tant que tel, l'analyse à haut débit et le contrôle de la qualité des systèmes cellulaires complexes restent un défi permanent. L'histologie est la méthode de référence pour l'analyse de la micro-anatomie des tissus ; ainsi, l'analyse histologique des modèles cellulaires 3D est une conséquence logique. Combiné à l'immunohistochimie, il fournit des informations sur la morphologie et la composition des tissus avec la visualisation de protéines ou d'antigènes spécifiques. La micro-histologie est une technique puissante de contrôle de la qualité à toutes les étapes procédurales du développement de la technologie des micro-tissus avec un besoin croissant d'analyse des points finaux (Fig. 1).

Chaîne de traitement des micro-tissus montrant le besoin croissant de micro-histologie. En plus de l'analyse des points finaux et en donnant accès à la micro-anatomie et à la biologie des micro-tissus, la micro-histologie permet de déterminer l'effet des étapes de traitement sur les échantillons (par exemple, le stress ou les dommages affectant la morphologie et les fonctions biologiques, lorsqu'ils sont combinés avec immunohistochimie). Ainsi, c'est la méthode de choix pour le contrôle de la qualité pour la mise en œuvre de nouvelles méthodes au service du flux complet du processus micro-tissu, de la production au développement du modèle tissulaire. Créé avec BioRender.com.

Cependant, les processus histologiques actuels ne sont pas adaptés pour manipuler les micro-tissus car ils sont plus petits que les échantillons de biopsie et presque transparents. En plus de cela, les problèmes techniques de manipulation peuvent également conduire à un traitement lent et lourd, produisant des résultats avec un rendement limité qui ne peuvent pas être reproduits avec l'automatisation6.

Initialement, le traitement histologique nécessite que les micro-tissus soient intégrés dans un hydrogel, par exemple, l'agarose, afin de faciliter leur manipulation pour l'intégration ultérieure dans la paraffine7,8. Lors de l'enrobage aléatoire, des dizaines de répliques de micro-tissus sont nécessaires pour s'assurer que suffisamment de matériel approprié est disponible pour une analyse histologique pertinente. Ce nombre de répétitions semble inutilement élevé, et une grande partie du matériel pourrait être gaspillée étant donné qu'il pourrait être plus efficace d'analyser moins de sections d'échantillons, d'autant plus que l'alignement précis de 5 à 10 micro-tissus dans le même plan focal pourrait fournir suffisamment informations pour une analyse solide. Il est possible d'aligner plusieurs échantillons plus efficacement dans un plan, par exemple par centrifugation de micro-tissus dans de l'agarose à 0,5 % dans un cryotube, ce qui a été évoqué dans une étude récente9. Cependant, l'approche de mise en commun utilisée dans cette étude reste coûteuse et gaspille encore du matériel biologique précieux.

Alternativement, le transfert et le positionnement manuels des micro-tissus prennent trop de temps et provoquent des goulots d'étranglement lors de l'automatisation. Au lieu de cela, une alternative élégante à l'enrobage manuel et aléatoire d'agarose repose sur l'enrobage d'hydrogel parallélisé à l'aide de microréseaux tissulaires (TMA)7,8. Les TMA fonctionnent bien pour positionner les échantillons dans des arrangements 2D et permettent la mise en œuvre de méthodes de format standard utilisées dans la culture cellulaire, par exemple des plaques multipuits. Avec la TMA, la traçabilité de chaque condition expérimentale peut également être garantie et peut être appliquée en conséquence à des modèles cellulaires 3D10,11 et à l'histologie de modèles de petits organismes, tels que les larves de poisson zèbre12. Cependant, le positionnement vertical aléatoire des échantillons dans un bloc de gel obtenu rend peu probable que tous les micro-tissus soient situés dans la même section. Malgré la réduction du nombre de micro-tissus par condition expérimentale par rapport à la mise en commun, la TMA nécessite encore le traitement de nombreuses sections (par exemple, colorées et imagées) pour obtenir toutes les données pertinentes sur les échantillons, ce qui entraîne des coûts de matériel élevés et de longs délais de traitement. -résultats.

Plusieurs autres études ont étudié différentes approches dans le but d'obtenir une parallélisation élevée de l'enrobage de micro-tissus à des fins histologiques (comprenant la coupe, la coloration et l'imagerie). Une méthode consistait à étudier jusqu'à 96 sphéroïdes en parallèle, en utilisant un bloc d'agarose conçu avec un réseau de puits cylindriques remplis manuellement afin d'analyser l'impact du désalignement dans le plan de section8. Une autre étude a utilisé la centrifugation à travers un collecteur à entonnoir pour charger des micro-tissus dans un bloc d'agarose avec un réseau de puits cylindriques13. Néanmoins, il a fallu manipuler manuellement la plaque pour préparer le transfert. D'autres publications14,15,16 ont proposé la formation et la culture des modèles cellulaires 3D et leur encastrement sur le même dispositif. Cependant, ce matériel de laboratoire est très spécifique et incompatible avec les plates-formes de production de micro-tissus standard existantes. À la connaissance de ces auteurs, la coplanarité des spécimens dans le bloc de gel n'a pas fait l'objet d'une enquête. De plus, le traitement histologique peut affecter la géométrie du bloc d'agarose et la position relative des échantillons intégrés.

Cet article propose une méthode rentable et efficace pour le traitement histologique à haut débit des micro-tissus. Une méthode conviviale et robuste est décrite pour la préparation de plusieurs échantillons dans un format de tableau standard à l'aide d'un substrat à base d'agarose : HistoBrick (Fig. 2). HistoBrick a été conçu pour faciliter le positionnement des échantillons, l'inclusion de gel, la déshydratation, l'inclusion de paraffine, la coupe et l'imagerie optique tout en réduisant le nombre de sections requises nécessitant une analyse en alignant les échantillons sur un plan singulier. L'alignement relatif des spécimens dans HistoBrick et le positionnement du bloc sur un microtome peuvent être évalués. De plus, l'approche d'HistoBrick est compatible avec le format standard des processus d'automatisation et ouvre la voie à la standardisation et à l'automatisation à haut débit de la micro-histologie.

Schéma montrant le pipeline d'analyse histologique sur des micro-tissus. HistoBrick fournit l'alignement coplanaire et la disposition des matrices nécessaires pour relier la production de modèles cellulaires 3D et le traitement histologique à l'analyse à haut débit des sections fixées au formol et incluses en paraffine. Créé avec BioRender.com.

Deux moules en silicone contenant 96 piliers verticaux ont été conçus à l'aide de SolidWorks (Dassault Systèmes), sur la base de la configuration du pas de matrice de plaques 1536 puits commerciales. Les piliers mesurent 1,5 mm de diamètre et 15 mm de hauteur. Comme le montre la figure 3, les piliers ont été délibérément positionnés au milieu du moule, avec deux espaces ouverts laissés disponibles de chaque côté, qui une fois remplis aident à faciliter la manipulation de l'hydrogel pendant le moulage et le démoulage. La distance entre les piliers et le fond du moule mesure 2 mm de hauteur, offrant suffisamment d'espace pour injecter l'hydrogel nécessaire à l'obtention d'un HistoBrick. Les conceptions de moules ont été imprimées en 3D avec du silicone A 50 chez Spectroplast AG, Suisse.

Conception Histobrick et bloc hydrogel. (a) CAO du moule pour la préparation d'un HistoBrick 96 puits, (b) Moule en silicone fabriqué par impression 3D, (c) HistoBrick à base d'hydrogel contenant 96 puits.

Les principales étapes impliquées dans la préparation d'HistoBrick sont décrites dans les Fig. 4a–d. De l'agarose (Sigma-Aldrich, A7174) a été ajouté à l'HistoGel préchauffé (Epredia, HG-4000-012) dans un rapport p/v de 1,5 à 2 %, et la solution a été agitée dans un bain-marie à 80 °C jusqu'à ce que l'agarose ait complètement dissous. Le moule en silicone a été placé avec les piliers vers le bas sur une boîte de Pétri ; l'ensemble ayant été préchauffé dans un four à 80°C. Ensuite, 10 ml du mélange agarose-HistoGel ont été doucement versés dans le moule en silicone chauffé. Ces éléments ont ensuite été laissés refroidir à température ambiante pendant 10 min. Ensuite, le bloc a été laissé gélifier à 4 °C pendant 2 h pour obtenir une stabilité mécanique suffisante pour le démoulage. L'HistoBrick solidifié a été libéré du moule sur une boîte de Pétri en appliquant une légère pression manuelle dans la zone médiane tout en tenant les deux côtés. L'HistoBrick obtenu a été stocké à 4 °C dans de l'eau déminéralisée et utilisé dans les 14 jours. Pour permettre une meilleure visualisation des puits avant et après le traitement histologique, des échantillons HistoBrick supplémentaires ont été préparés en ajoutant un colorant bleu (Davidson Tissue Dye) au mélange agarose-HistoGel.

Préparation et utilisation d'HistoBrick. (a) Placez le moule en silicone dans une boîte de Pétri en verre avec les piliers vers le bas et remplissez le moule avec le mélange agarose-HistoGel par les ouvertures latérales, (b) Le moule rempli doit ensuite être refroidi à 4–5 °C pendant 2 h, (c) Démouler l'HistoBrick en appuyant sur les côtés, (d) Démouler l'HistoBrick, (e) Charger les micro-tissus fixés, (f) Ajouter HistoGel dans les puits et refroidir à 4–5 °C, (g) Couper le bloc à l'aide de l'outil de tranchage, (h) Après avoir divisé l'HistoBrick en trois segments, les deux segments latéraux peuvent être jetés et le segment central contenant les puits doit être réservé pour le traitement histologique, (i) Placer le segment central de l'HistoBrick dans une histologie cassette.

Dans ce travail, des investigations ont été menées à l'aide d'échantillons de sphéroïdes de carcinome hépatocellulaire humain (HepG2) (HB-8065, ATCC) (diamètre moyen de 150 à 200 µm) générés à l'aide de Sphericalplate 5D (SP5D, Kugelmeiers Ltd.). Un protocole détaillé pour leur préparation peut être trouvé dans les méthodes supplémentaires S1. Les micro-tissus HepG2 fixés ont été transférés manuellement d'un tube Eppendorf à l'HistoBrick, en pipetant un micro-tissu dans chaque puits à l'aide d'une pipette à un ou plusieurs canaux (Fig. 4e). Les pointes de pipette (20 µl) ont été pré-enduites d'albumine de sérum bovin (BSA) à 1 % (A3059, Sigma-Aldrich) pour empêcher l'adhérence des micro-tissus. Chaque micro-tissu a été aspiré avec environ 5 µl de son tampon aqueux. La pointe chargée a été placée près du fond du puits HistoBrick sans toucher le gel, et l'échantillon a été distribué lentement pour éviter le piégeage des bulles d'air. Les micro-tissus ont été laissés se déposer et sédimenter dans le puits pendant 5 min. Après transfert des micro-tissus, le moule a été laissé absorber le milieu aqueux supplémentaire pendant environ 1 h. Avec une nouvelle pointe, 10 à 20 µl d'HistoGel préchauffé à 80 °C ont été ajoutés à chaque puits (Fig. 4f). Enfin, l'HistoBrick a été laissé refroidir pendant 1 h à 4 ° C afin que le processus de gélification puisse se produire. Il a ensuite été stocké à 4 ° C dans de l'eau déminéralisée et utilisé dans les 3 jours.

Plusieurs méthodes ont été développées et testées pour étudier le transfert de micro-tissus HepG2 d'une plaque à puits initiale à un HistoBrick, en utilisant un système de manipulation de liquide Microlab STAR (Hamilton) équipé de huit têtes de pipetage et du logiciel Venus version 2.1. Des micro-tissus HepG2 fixes ont été placés (un par puits) dans une plaque à puits multiples à 96 puits Corning Costar Ultra-Low Attachment (ULA) (CLS7007, Merck) avec 1 micro-tissu dans 200 µl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS Gibco 2062235 ) dans chaque puits. Le matériel de laboratoire jumeau numérique a été créé pour prendre en charge l'HistoBrick, qui a été positionné sur le pont à l'aide d'un support dédié. Les méthodes de transfert comprenaient le pré-revêtement des pointes avec du BSA.

Les HistoBricks chargés de micro-tissus HepG2 fixes, comme décrit précédemment, ont été coupés pour les insérer dans une cassette d'histologie (Fig. 4g – i). Un outil de tranchage personnalisé a été conçu à cette fin, comme décrit dans les méthodes supplémentaires S2. Le processus histologique comprenait une étape de déshydratation suivie d'une clarification et d'une inclusion de paraffine, qui ont été réalisées selon les procédures de laboratoire standard. Le bloc inclus en paraffine a été placé sur un microtome Leica RM2265 pour la coupe. Au total, 75 sections ont été obtenues à partir d'un HistoBrick. L'épaisseur de chaque tranche était de 4 µm. Chacune des trois tranches a été colorée avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E) selon les protocoles standard après avoir été montée sur une lame de verre.

Les images des sections colorées ont été acquises avec un scanner de diapositives entières Olympus VS120. Initialement, une image d'ensemble de la lame de verre entière a été acquise à un grossissement de 4 × pour identifier les zones contenant des micro-tissus. Ensuite, plusieurs micro-tissus répartis sur toute la tranche d'échantillon ont été sélectionnés et mis au point pour aider à corriger l'inclinaison de la lame de verre pendant le processus de numérisation. Enfin, une image à plus fort grossissement (10 × ou 20 ×) de toute la section a été acquise par numérisation.

Des échantillons d'HistoBrick teints en bleu ont été préparés pour une meilleure visualisation et leurs puits ont été remplis d'HistoGel non coloré pour évaluer leur diamètre à différentes étapes (notamment sur l'HistoBrick fraîchement préparé et sur les lames obtenues après traitement histologique). Une image en fond clair des échantillons a ensuite été prise à l'aide d'un microscope inversé (Carl Zeiss Microscopy GmbH) et les diamètres des puits ont été mesurés sur la base d'un ajustement circulaire manuel à l'aide de la plateforme open source FIJI17.

Les images ont été traitées dans la plateforme FIJI17 et le module TrackEM18 a été utilisé pour aligner les réseaux de puits des différentes sections. Les images ont subi deux processus, d'abord des points de repère ont été sélectionnés manuellement sur chaque image pour garantir la fiabilité des performances d'alignement. Deuxièmement, une transformation rigide automatisée des images a été appliquée à la pile complète pour fixer l'alignement. Par la suite, l'emplacement du plan de l'équateur de chaque micro-tissu a été identifié visuellement comme étant le plan contenant la plus grande section du micro-tissu correspondant sur toute la pile d'images. Lorsque deux coupes consécutives d'un micro-tissu ont été identifiées comme étant remarquablement similaires, leur plan équatorial a été choisi comme étant celui centré entre les deux coupes. Lorsque plusieurs micro-tissus ont été intégrés dans le même puits, puisque les emplacements de leur plan équatorial étaient très proches (< 15 µm de différence), ils ont été moyennés ensemble. Cette procédure a équilibré la contribution de chaque puits lors de l'ajustement sur les emplacements spatiaux 3D et a assuré que le meilleur plan d'ajustement n'était pas biaisé par les puits contenant des micro-tissus supplémentaires. Les emplacements 3D ont ensuite été traités dans MATLAB (2012, MathWorks) pour identifier le meilleur plan d'ajustement via la minimisation de l'erreur quadratique moyenne pour chacun des échantillons HistoBrick traités.

Les blocs HistoBrick composés d'agarose peuvent être facilement produits à l'aide du moule en silicone dédié. Les 96 puits de l'HistoBrick mesurent 1,7 ± 0,1 mm de diamètre après stabilisation dans de l'eau déionisée, ce qui entraîne un écart de 6 % par rapport au diamètre du pilier du moule. Cependant, le pas d'un réseau standard de 1 536 est conservé, ce qui faciliterait le chargement des échantillons à l'aide d'un manipulateur de liquide automatisé.

HistoBrick convient aux étapes de traitement histologique, y compris la déshydratation, l'inclusion de paraffine, la coupe avec un microtome et la coloration. La comparaison des figures 5c et d montre l'importance d'avoir un colorant bleu pour faciliter la visualisation des puits. Pour déterminer l'effet du traitement sur le bloc d'hydrogel composite, les diamètres des puits (D) et le pas du réseau dans deux axes (P1 et P2) ont été mesurés sur les tranches de deux échantillons HistoBrick de couleur bleue avec des micro-tissus HepG2 intégrés (Fig. 5c–f). Les résultats montrent un rétrécissement de 34 % du diamètre du puits. Le pas mesuré après traitement histologique était de 1,7 mm, correspondant à une réduction de 28 %. Aucune bulle d'air n'a été observée après l'enrobage du gel ou à l'intérieur des coupes histologiques (Fig. 5a). Les micro-tissus HepG2 sont restés intacts après la coloration H&E (Fig. 5b).

Images de micro-tissus HepG2 dans un HistoBrick subissant différentes étapes de traitement. (a) Un micro-tissu HepG2 (pointé par la flèche) après avoir été intégré dans l'HistoBrick et recouvert d'HistoGel. Notez qu'aucune bulle d'air n'est emprisonnée à l'intérieur du micro-puits, (b) coloration H&E d'une section d'un seul micro-tissu, (c) image de microscopie d'une tranche sans colorant. Les contours des puits sont difficiles à déterminer. ( d ) Image microscopique d'une tranche à l'aide d'une tache de couleur bleue. Notez que les contours du puits sont clairement visibles. (e) Mesurer le diamètre et le pas des puits dans l'HistoBrick avant l'inclusion de paraffine, (f) Mesurer le diamètre et le pas des puits dans l'HistoBrick après la section. Le paramètre D est le diamètre tandis que P1 et P2 sont utilisés pour comparer le pas sur les deux axes du réseau de micropuits.

Étant donné que le débit de l'analyse histologique dépend fortement de la façon dont les micro-tissus sont positionnés dans le bloc lors de l'étape de la procédure de sectionnement, les auteurs de cet article ont caractérisé l'alignement des micro-tissus HepG2 en utilisant l'approche spécialisée HistoBrick. Pour cette approche, les échantillons de micro-tissus se déposent et sédimentent au fond des puits, ce qui entraîne un alignement sur un plan horizontal. La figure 6a montre trois exemples d'images en fond clair prises des sections obtenues pour un échantillon HistoBrick à 96 puits après coloration H&E. Les micro-tissus HepG2 sont facilement identifiés comme des taches sombres dans les limites des puits. En raison du chargement manuel imprécis d'HistoBrick à partir d'une suspension d'échantillon, les puits sont parfois vides ou contiennent jusqu'à trois micro-tissus. La figure 6b illustre le positionnement des microtissus dans un HistoBrick le long de l'axe Z, par rapport à la première section d'histologie et au meilleur plan d'ajustement. La figure 6c montre la position de plusieurs microtissus de la première section d'histologie dans cinq blocs HistoBrick (en bleu) et 2 autres blocs préparés à l'aide de l'outil de positionnement (en vert). En supposant que le processus histologique a entraîné des surfaces parallèles de la paraffine et de l'échantillon HistoBrick d'origine, le plan d'alignement forme un angle de 0,22 ± 0,06° avec le plan de coupe. Cet angle pourrait avoir un impact significatif sur l'analyse, car il représente un désalignement relatif d'environ 70 µm entre deux microtissus dans les premier et douzième puits le long d'une ligne du tableau HistoBrick. L'angle d'inclinaison étant différent pour chaque échantillon HistoBrick, le meilleur plan d'ajustement a été introduit pour permettre une comparaison directe des microtissus dans les sept échantillons (Fig. 6d). Pour tous les échantillons HistoBrick, indépendamment de l'utilisation de l'outil d'alignement, 75% des microtissus ont leur centre situé en moyenne à ± 40 µm du plan de meilleur ajustement. En d'autres termes, 75 % des microtissus ont leur centre situé dans une bande de 80 µm d'épaisseur dans le bloc.

Coplanarité des micro-tissus HepG2 inclus. ( a ) Images en fond clair de trois lames colorées H & E du même bloc traité. Les disques clairs correspondent aux puits et les points sombres correspondent aux micro-tissus, comme dans l'exemple entouré de pointillés, (b) Schéma de la position des sphéroïdes dans l'HistoBrick. Le plan de meilleur ajustement (ligne jaune) est un plan imaginaire permettant de compenser l'angle d'inclinaison (en rouge, l'angle formé par le plan de meilleur ajustement avec le plan de la lame du microtome) qui résulte du positionnement manuel du bloc sur le microtome, ( c ) Distance du centre des micro-tissus à partir de la première section d'histologie pour sept échantillons HistoBrick différents [5 HistoBricks ont été coupés sans outil d'alignement (boîtes bleues) et deux HistoBricks ont été coupés avec un outil d'alignement (boîtes vertes)]. (d) Distance absolue du centre des micro-tissus par rapport au meilleur plan d'ajustement pour les sept mêmes échantillons HistoBrick.

Pour évaluer l'intégration d'HistoBrick dans un flux de travail automatisé, différentes méthodes ont été testées à l'aide d'un gestionnaire de liquide automatisé et d'une plaque ULA à 96 puits. Chaque puits contenait un micro-tissu HepG2 avec 200 µl de PBS. Chaque puits de l'HistoBrick permet théoriquement la collecte d'un volume de 2 à 10 µl. L'approche développée consistait en trois étapes principales, comme illustré à la Fig. 7. Tout d'abord, le prélèvement d'un micro-tissu HepG2 de la plaque ULA n'a réussi que lorsque l'aspiration complète du volume du puits (200 µl) à l'aide de 300 µl d'embouts en carbone a été réalisée. appliqué. Aucune aspiration de volume partiel testée n'a réussi à attraper les microtissus. Dans un second temps, une pause a été mise en place afin que le micro-tissu puisse sédimenter au fond de la pointe. Enfin, la distribution a été étudiée en deux phases. Dans la première phase de test, le contenu de la pointe a été complètement distribué dans une plaque standard de 96 puits. Avec cette approche, 87,5 % des sphéroïdes HepG2 ont été récupérés, transférés et distribués avec succès. Cette performance dépendait du revêtement de l'embout de distribution (avec BSA), de la taille du sphéroïde et de l'adhérence du micro-tissu au fond de la plaque. Dans la deuxième phase de test, la distribution de volume partiel a été testée pour atteindre la plage de volume d'un puits HistoBrick (2 à 10 µl). Cependant, la distribution par jet partiel des microtissus dans un volume inférieur à 20 µl à partir des 200 µl prélevés n'a pas pu être réalisée de manière reproductible. Les limitations techniques du matériel, ainsi que l'optimisation complexe de la méthode semblaient être des facteurs limitants, et le transfert automatisé un à un de micro-tissus HepG2 de 150 à 200 µm n'était pas possible avec cette plate-forme robotique.

Développement d'une méthode pour le transfert de micro-tissus HepG2 de 150 à 200 µm à l'aide d'un manipulateur de liquide automatisé de laboratoire. Créé avec BioRender.com.

L'application des modèles cellulaires 3D dans les domaines de la recherche et de la médecine personnalisée se développe progressivement car ils permettent des investigations détaillées sur les mécanismes de la maladie, les approches thérapeutiques in vitro et la planification des thérapies. L'utilisation de cellules dérivées de patients est un atout majeur, mais la source cellulaire est limitée. Dans ce contexte, la recherche basée sur les micro-tissus doit être fiable tout au long de la chaîne de traitement. Cela inclut, mais sans s'y limiter, la production de micro-tissus, la maturation, les tests et l'analyse du point final. Dans ce contexte, il existe un besoin de standardisation (qui nécessite souvent une automatisation) des méthodes analytiques qui supportent le développement et la validation des procédés expérimentaux.

Cet ensemble de travaux visait à faciliter l'analyse histologique des micro-tissus en mettant en œuvre une approche TMA axée sur la rentabilité, la traçabilité et le respect des procédures de laboratoire à haut débit. Des études antérieures ont montré l'avantage d'utiliser une approche TMA, mais ces examens ont été effectués sur des échantillons plus grands (de l'ordre de 500 µm de diamètre)7,8,10,11. La nouvelle approche présentée dans cet article, HistoBrick, utilise non seulement de petits micro-tissus HepG2 (150 à 200 µm de diamètre), mais elle permet également l'alignement précis des échantillons et est compatible avec différents matériels standard.

HistoBrick faciliterait la micro-histologie à haut débit en mettant en œuvre un matériel de laboratoire hydrogel facile à utiliser pour l'intégration coplanaire de modèles cellulaires 3D, dont la conception a été rendue compatible avec les normes d'automatisation. Les données recueillies sur HistoBrick démontrent qu'il est possible d'entreprendre et de recueillir des résultats histologiques pour jusqu'à 96 échantillons en utilisant une sélection plus petite de 13 tranches. Le moule en silicone conçu facilite la réplication des puits à échelle méso dans l'hydrogel à base d'agarose, ce qui donne un dispositif multipuits qui peut être stocké dans des conditions humides pendant au moins 14 jours avant le chargement de l'échantillon. La flexibilité du moule et sa conception avec les deux ouvertures des deux côtés du réseau permettent une flexion suffisante lors du démoulage et aident à prévenir la rupture du gel. De plus, la méthode d'HistoBrick est exclusivement basée sur la décantation et la sédimentation passives des échantillons lorsqu'ils sont chargés dans les puits et aucune étape de manipulation supplémentaire n'est requise après le transfert du micro-tissu. En termes de performances, HistoBrick présente une compatibilité satisfaisante avec l'ensemble du processus histologique. Bien que les dimensions des puits, des matrices et des échantillons soient affectées par les procédures de déshydratation et d'inclusion de paraffine, il est possible de tracer clairement les échantillons car leur disposition 2D est conservée. De plus, ils sont alignés sur un plan avec une plage de précision d'environ 80 µm après traitement histologique. Ceci est particulièrement pertinent car les résultats ont été obtenus avec de petits micro-tissus HepG2 (150 à 200 µm de diamètre) de sorte que la précision d'alignement obtenue est proche de la dispersion de la taille de l'échantillon. Les plates-formes de production de micro-tissus standardisées les plus récentes garantissent une taille uniforme parmi un réseau19,20,21. La méthode d'alignement étant basée sur la sédimentation, HistoBrick répond particulièrement aux besoins analytiques de telles plateformes.

Une étude précédente a démontré l'importance du positionnement des blocs d'agarose sur un microtome lors de l'évaluation des performances d'alignement8. Dans cette étude, une TMA à base d'agarose a été mise en contact avec une cassette d'histologie avec de l'agarose, fournissant un support pour la section du bloc de gel, tandis que les échantillons de micro-tissus étaient situés au sommet des piliers faisant face à la lame. Les blocs HistoBrick ont d'abord été déshydratés et enrobés de paraffine sans aucun support et le plan d'alignement de l'échantillon obtenu ne présentait qu'un angle de 0,2° à 0,3° avec la lame du microtome. Un outil personnalisé a été conçu pour une étape d'inclusion de paraffine complémentaire pour aider à aligner le bloc avec la lame, ce qui serait utile à l'avenir pour les utilisateurs moins expérimentés de la technologie. Cependant, il a été décidé de ne pas étudier l'efficacité de l'outil dans ce cas, car l'alignement a été parfaitement organisé par un utilisateur hautement qualifié pour cet article. Comme l'alignement du bloc avec la lame dépend fortement de l'opérateur, le développement d'un outil spécialisé pour aider à normaliser ce processus était toujours considéré comme une étape importante dans le développement d'HistoBrick afin qu'il puisse être facilement déployé à l'avenir.

Les puits d'HistoBrick ont été conçus comme un réseau de 96 puits sur une grille de 1536 pour se conformer aux normes d'automatisation des plates-formes de manipulation de liquides. Si le format et le positionnement d'HistoBrick sur la disposition du pont étaient réussis, des limitations ont été rencontrées pour la procédure automatisée de transfert de micro-tissus un à un. Idéalement, chaque micro-tissu de la plaque à 96 puits aurait été prélevé avec 2 à 10 µl de PBS et directement transféré sur HistoBrick, puis incorporé avec HistoGel. Cependant, le prélèvement réussi de micro-tissus uniques à partir d'une plaque ULA à fond rond n'a été possible qu'avec l'aspiration du volume complet de 200 µl, les micro-tissus étant situés au hasard dans le puits. Après avoir activé la sédimentation de l'échantillon dans la pointe, la distribution partielle de 2 à 10 µl dans le puits HistoBrick n'a pas pu être réalisée. Les conditions testées dans ce travail visaient à tester le transfert un à un à l'aide d'une plate-forme de manipulation de liquide standard, avec des micro-tissus isolés dans des puits uniques comme entrée. Ces conditions de départ ont été ingénieusement considérées comme un cas d'école, étant donné que les plateformes de production de micro-tissus standardisés à grande échelle reposent soit sur un pool de micro-tissus dans un volume plus important (< 1 ml), soit sur des micro-tissus isolés dans un petit volume (< 100 µl)22. Alors que des processus tels que le pipetage de réactifs et l'échange de milieu sont des opérations standard des systèmes d'automatisation de laboratoire, le transfert de modèles cellulaires 3D reste difficile. Cela est principalement dû au positionnement précis de la pointe de la pipette au-dessus du modèle cellulaire 3D lors de l'aspiration, ce qui nécessite une rétroaction optique. Sans cela, une cueillette réussie du micro-tissu n'est accessible qu'avec un plus grand volume de liquide. Ensuite, la distribution partielle requise de petites quantités de liquide (< 20 µl) est difficile voire impossible avec un équipement classique. Bien que la bio-impression de modèles cellulaires 3D soit un domaine émergent23 et que des opérations de prélèvement et de placement de constructions plus grandes aient été démontrées24, on trouve peu d'opérations de prélèvement et de placement pour le transfert distinct de modèles cellulaires 3D d'un endroit à un autre.

Dans cette étude, HistoBrick fournit une méthode conviviale, rentable et robuste pour l'enrobage d'échantillons avec l'alignement coplanaire de jusqu'à 96 micro-tissus. La technologie garantit une forte réduction du nombre d'échantillons perdus lors du traitement histologique, économisant ainsi du matériel biologique précieux. L'approche HistoBrick facilite l'analyse standardisée des échantillons à l'aide de la microhistologie. L'utilisation efficace des cellules dérivées de patients est essentielle pour promouvoir la mise en œuvre généralisée de modèles cellulaires 3D dans la recherche et la médecine stratifiée. Le déploiement complet de la méthode repose désormais sur le développement de plates-formes de manipulation de liquides permettant le transfert efficace de plusieurs modèles de cellules 3D d'un labware à un autre.

Toutes les données décrites dans ce manuscrit et tous les détails des méthodes décrites seront facilement disponibles sur demande adressée à l'auteur correspondant.

Kim, J., Koo, B.-K. & Knoblich, JA Organoïdes humains : systèmes modèles pour la biologie humaine et la médecine. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 21, 571–584 (2020).

Article CAS Google Scholar

Schneeberger, K. et al. Biofabrication convergente et technologies organoïdes : la prochaine frontière de l'ingénierie tissulaire hépatique et intestinale ?. Biofabrication 9, 013001 (2017).

Annonces d'article Google Scholar

Driehuis, E., Kretzschmar, K. & Clevers, H. Création d'organoïdes cancéreux dérivés de patients pour des applications de dépistage de médicaments. Nat. Protocole 15, 3380–3409 (2020).

Article CAS Google Scholar

Lancaster, MA & Knoblich, JA Organogenèse dans un plat : Modélisation du développement et de la maladie à l'aide de technologies organoïdes. Sciences 345, 1247125 (2014).

Article Google Scholar

Bock, C. et al. L'atlas des cellules organoïdes. Nat. Biotechnol. 39, 13-17 (2021).

Article CAS Google Scholar

Olsen, TR et al. Traitement des sphéroïdes cellulaires pour examen histologique. J. Histotechnol. 37, 138-142 (2014).

Article Google Scholar

Yan, P., Seelentag, W., Bachmann, A. & Bosman, FT Une matrice d'agarose facilite la section des blocs de microréseaux tissulaires. J. Histochem. Cytochem. 55, 21-24 (2007).

Article CAS Google Scholar

Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, JH & Beachley, V. Microarray enrobage/sectionnement pour l'analyse parallèle de sphéroïdes cellulaires 3D. Sci. Rep. 9, 16287 (2019).

Annonces d'article Google Scholar

Zhang, S.-W. et coll. Une méthode efficace et conviviale pour l'analyse cytohistologique des organoïdes. J. Tissue Eng. Régén. Méd. 15, 1012-1022 (2021).

Article CAS Google Scholar

Decembrini, S., Hoehnel, S., Brandenberg, N., Arsenijevic, Y. & Lutolf, MP Matrices de millipuits à base d'hydrogel pour des cultures d'organoïdes rétiniennes standardisées et évolutives. Sci. Rep. 10, 10275 (2020).

Article ADS CAS Google Scholar

Kabadi, PK et al. Dans les profondeurs : Techniques de visualisation tridimensionnelle in vitro des micro-tissus. Biotechniques 59, 279–286 (2015).

Article CAS Google Scholar

Sabaliauskas, NA et al. Histologie du poisson zèbre à haut débit. Méthodes 39, 246–254 (2006).

Article CAS Google Scholar

Weisler, W., Miller, S., Jernigan, S., Buckner, G. & Bryant, M. Conception et test d'un dispositif fluidique centrifuge pour peupler des microréseaux de cultures de cellules cancéreuses sphéroïdes. J. Biol. Ing. 14, 7 (2020).

Article CAS Google Scholar

Thomsen, AR et al. Un réseau de micropuits d'agarose conique profond pour la culture cellulaire tridimensionnelle indépendante de l'adhésion et la mesure dynamique du volume. Laboratoire. Puce 18, 179–189 (2017).

Article Google Scholar

Simeone, K. et al. Lithographie en paraffine et puces tissulaires micro-disséquées : outils d'analyse biologique et pharmacologique des tumeurs solides ex vivo. Laboratoire. Puce 19, 693–705 (2019).

Article CAS Google Scholar

Kuriu, S., Kadonosono, T., Kizaka-Kondoh, S. & Ishida, T. Tranchage de sphéroïdes dans des dispositifs microfluidiques pour l'analyse morphologique et immunohistochimique. Micromachines 11, 480 (2020).

Article Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidji : une plate-forme open source pour l'analyse d'images biologiques. Nat. Méthodes 9, 676–682 (2012).

Article CAS Google Scholar

Cardona, A. et al. Logiciel TrakEM2 pour la reconstruction de circuits neuronaux. PLoS ONE 7, e38011 (2012).

Article ADS MathSciNet CAS Google Scholar

Wassmer, C.-H. et coll. Ingénierie des sphéroïdes de cellules d'îlots pancréatiques primaires pour la culture ou la transplantation en trois dimensions : une étude comparative méthodologique. Transplantation cellulaire. 29, 0963689720937292 (2020).

Article Google Scholar

Brandenberg, N. et al. Culture organoïde automatisée à haut débit via l'agrégation de cellules souches dans des réseaux de microcavités. Nat. Biomédical. Ing. 4, 863–874 (2020).

Article CAS Google Scholar

Wardwell-Swanson, J. et al. Un cadre pour optimiser l'imagerie à haut contenu de modèles 3D pour la découverte de médicaments. SLAS Découverte. Adv. Sci. Découverte de drogue. 25, 709–722 (2020).

Article Google Scholar

Velasco, V., Shariati, SA & Esfandyarpour, R. Méthodes basées sur la microtechnologie pour les modèles organoïdes. Microsystème. Nanoeng. 6, 76 (2020).

Article ADS CAS Google Scholar

Jakab, K. et al. Ingénierie tissulaire par auto-assemblage et bio-impression de cellules vivantes. Biofabrication 2, 022001 (2010).

Annonces d'article Google Scholar

Blakely, AM, Manning, KL, Tripathi, A. & Morgan, JR Bio-cueillir, placer et perfuser : un nouvel instrument pour l'ingénierie tissulaire tridimensionnelle. Tissue Eng. Partie C Méthodes 21, 737–746 (2015).

Article CAS Google Scholar

Télécharger les références

Les auteurs remercient Jessica Sordet-Dessimoz et son équipe de la Plateforme d'Histologie de l'EPFL pour le traitement des échantillons pour l'histologie. Cette recherche a été soutenue par l'Agence suisse pour l'innovation dans le cadre du projet Innosuisse 39848.1 IP-LS.

CSEM SA, Jaquet-Droz 1, 2002, Neuchâtel, Suisse

Sarah Heub, Fatemeh Navaee, Daniel Migliozzi, Diane Ledroit, Stéphanie Boder-Pasche, Jonas Goldowsky, Emilie Vuille-Dit-Bille, Vincent Revol & Gilles Weder

École des sciences de la vie, Université des sciences appliquées et des arts de la Suisse du Nord-Ouest, 4132, Muttenz, Suisse

Joëlle Hofer, Carine Gaiser & Laura Suter-Dick

Centre suisse de toxicologie humaine appliquée (SCAHT), 4001, Bâle, Suisse

Laura Suter-Dick

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

SH a conçu l'idée d'HistoBrick. DM a conçu le moule. FN a conçu les outils de coupe et d'alignement. DM et FN ont exécuté les expériences d'optimisation du gel hydrogel et de la méthode. FN a produit les micro-tissus HepG2 et réalisé les expériences d'alignement. JH et CG ont testé HistoBrick et ont contribué à l'optimisation du protocole. DM a développé la méthode de traitement d'image et EV-D.-B. a fait l'analyse statistique du positionnement des microtissus. DL et JG ont étudié les méthodes de transfert automatisé. SH a coordonné la préparation du manuscrit. CG, LS-D., VR, SB-P. et GW a évalué les données et examiné le manuscrit.

Correspondance avec Sarah Heub.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons et indiquer si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Heub, S., Navaee, F., Migliozzi, D. et al. Intégration coplanaire de plusieurs modèles cellulaires 3D dans un hydrogel vers une micro-histologie à haut débit. Sci Rep 12, 9991 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13987-4

Télécharger la citation

Reçu : 12 janvier 2022

Accepté : 31 mai 2022

Publié: 15 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-13987-4

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.