L'ablation Peli3 améliore l'acétaminophène

Médecine expérimentale et moléculaire (2023)Citer cet article

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Les voies de signalisation régissant les lésions hépatiques induites par l'acétaminophène (APAP) ont été largement étudiées. Cependant, on sait peu de choses sur les enzymes de modification de l'ubiquitine nécessaires à la régulation des lésions hépatiques induites par l'APAP. Ici, nous avons examiné si la protéine Pellino3, qui a une activité de ligase E3, est nécessaire pour les lésions hépatiques induites par l'APAP et avons ensuite exploré son mécanisme moléculaire. Les souris Peli3−/− knockout (KO) et Peli3 knockdown (KD) médiées par l'adénovirus ont montré des niveaux réduits de mort cellulaire centrolobulaire, d'infiltration de cellules immunitaires et de biomarqueurs de lésions hépatiques, tels que l'alanine aminotransférase (ALT) et l'aspartate aminotransférase (AST), lors du traitement APAP par rapport aux souris de type sauvage (WT). Le déficit en Peli3 dans les hépatocytes primaires a diminué les dommages mitochondriaux et lysosomiques et réduit les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) mitochondriales. De plus, les niveaux de phosphorylation au niveau de la sérine 9 dans le cytoplasme et la translocation mitochondriale de GSK3β étaient diminués dans les hépatocytes primaires obtenus à partir de souris Peli3−/− KO, et ces réductions s'accompagnaient de diminutions de la phosphorylation de JNK et de la translocation mitochondriale. Pellino3 s'est lié plus fortement à GSK3β par rapport à JNK1 et JNK2 et a induit la polyubiquitination médiée par la lysine 63 (K63) de GSK3β. Dans des expériences de sauvetage, l'expression ectopique de Pellino3 de type sauvage dans des hépatocytes Peli3−/− KO a restauré la translocation mitochondriale de GSK3β, mais cette restauration n'a pas été obtenue avec l'expression d'un mutant catalytiquement inactif de Pellino3. Ces résultats sont les premiers à suggérer un lien mécaniste entre Pellino3 et les lésions hépatiques induites par l'APAP via la modulation de la polyubiquitination de GSK3β.

L'acétaminophène (N-acétyl-p-aminophénol; APAP) est un analgésique léger et un antipyrétique couramment utilisé dans le monde. Cependant, une surdose d'APAP peut causer de graves lésions hépatiques qui évoluent vers une insuffisance hépatique aiguë et la mort, même si l'APAP est reconnu comme sûr à des doses thérapeutiques appropriées1. Un grand nombre de preuves accumulées au cours des dernières décennies indiquent que l'accumulation de N-acétyl-p-benzoquinone imine (NAPQI), le métabolite réactif et toxique de l'APAP, est la principale cause de lésions hépatiques induites par une surdose d'APAP2. Bien que de petites quantités de NAPQI, qui est métabolisé à partir de l'APAP par le cytochrome hépatique P450 2E1 (CYP2E1), puissent être détoxifiées par la conjugaison au glutathion (GSH), une formation excessive de NAPQI après un surdosage en APAP épuise rapidement le GSH hépatique et provoque ainsi la formation d'adduits protéiques, en particulier dans les protéines mitochondriales3,4. Cette formation d'adduits de protéines mitochondriales induit une génération excessive de superoxyde mitochondrial, qui peut réagir avec l'oxyde nitrique (NO) pour produire du peroxynitrite, et interfère ainsi avec la fonction des protéines par nitration des résidus de tyrosine protéique5,6. La protection contre l'hépatotoxicité induite par l'APAP par le mimétique de la superoxyde dismutase (SOD) Mito-TEMPO, ainsi que l'augmentation des lésions chez les souris partiellement déficientes en SOD, souligne l'importance du superoxyde dans ce processus7,8,9. En outre, plusieurs études sur les lésions hépatiques induites par l'APAP indiquent que l'oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS) est impliquée dans l'élévation du NO10,11,12. Ces modifications mitochondriales de l'hépatotoxicité APAP, telles que le stress oxydatif sévère et le stress nitrosatif, contribuent à l'ouverture des pores de transition de la perméabilité mitochondriale, ce qui entraîne une perte du potentiel membranaire mitochondrial et la libération d'endonucléases qui endommagent l'ADN13. Tous ces événements aboutissent finalement à une nécrose hépatocellulaire, bien que des études récentes aient également suggéré l'importance de la nécroptose14,15,16,17,18. La mort cellulaire nécrotique dans l'hépatotoxicité APAP libère des modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), y compris l'ADN mitochondrial, des fragments d'ADN nucléaire, la protéine High-mobility group box 1 (HMGB1) et l'ATP, ce qui entraîne une inflammation stérile19,20. Ces DAMP activent la signalisation de l'inflammasome en se liant aux récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) et favorisent le traitement de la pro-caspase-1, ce qui entraîne le traitement ultérieur de la pro-IL-1β ou de la pro-IL-18 en cytokines actives21. Ces cytokines semblent être responsables de l'activation et du recrutement des neutrophiles et des macrophages dérivés des monocytes dans le foie, bien que la question de savoir si ces cellules inflammatoires aggravent les lésions hépatiques ou facilitent la régénération reste controversée19. En plus de ces processus, il a été rapporté que l'autophagie joue un rôle important dans la facilitation de la récupération et de la régénération du foie22,23,24.

Malgré des études physiopathologiques approfondies sur les lésions hépatiques et les métabolites réactifs générés par un surdosage d'APAP, les voies de signalisation régissant cette hépatotoxicité sont susceptibles d'être plus compliquées que nos connaissances actuelles. De nombreuses études ont principalement démontré un rôle délétère de la c-Jun N-terminal kinase (JNK), une protéine kinase à sérine/thréonine appartenant à la superfamille des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK), dans l'hépatotoxicité induite par l'APAP25,26,27, 28,29,30. On pense que cette activation soutenue de JNK dans le cytosol et sa translocation mitochondriale lors d'un surdosage d'APAP amplifie le stress mitochondrial et nitrosatif médié par l'APAP31.

Dans l'hépatotoxicité médiée par l'APAP, il a été rapporté que l'activation de JNK était modulée par des protéines de signalisation en amont telles que GSK3β, MLK3 et ASK132,33,34. Cependant, des rapports récents indiquent également que la protéine kinase C (PKC) et la protéine kinase 1 interagissant avec le récepteur (RIPK1) participent à l'hépatotoxicité de l'APAP par l'activation de JNK35,36. Parmi ces kinases, GSK3β est connue pour être un médiateur important impliqué dans l'hépatotoxicité médiée par l'APAP par sa translocation dans les mitochondries ainsi que l'activation de JNK32.

Malgré les connaissances actuelles concernant les voies de signalisation impliquées dans l'hépatotoxicité de l'APAP, les systèmes de modification de l'ubiquitine dans les lésions hépatiques médiées par l'APAP sont moins bien compris que la phosphorylation des composants de signalisation. L'ubiquitination des protéines cibles s'est avérée cruciale pour divers processus cellulaires tels que la stabilité des protéines, la transduction du signal, l'endocytose et le trafic, et cette modification polyvalente est principalement médiée par les ligases d'ubiquitine E337. La protéine Pellino3, codée par le gène Peli3, fait partie de la famille Pellino composée de Pellino1, Pellino2 et Pellino338. Pellino3 a un domaine RING avec une activité E3 ligase et est impliqué dans diverses voies de signalisation inflammatoires, telles que la signalisation des récepteurs de type Toll, la signalisation NOD2 et les voies de signalisation TNF39,40,41,42. Fait intéressant, la surexpression des protéines Pellino3 facilite l'activation des MAPK telles que JNK et p3843,44. Ces résultats suggèrent fortement un rôle possible de Pellino3 dans l'hépatotoxicité médiée par l'APAP, qui n'a pas été abordé jusqu'à présent.

Dans cette étude, nous démontrons un rôle de la protéine Pellino3 dans l'hépatotoxicité médiée par l'APAP par son implication dans la translocation mitochondriale et la phosphorylation de GSK3β grâce à l'utilisation de Peli3−/− knockout (KO) corps entier et de Peli3 médié par l'adénovirus ( KD) modèles de souris. Ce rapport fournit la première identification d'une ligase d'ubiquitine E3 modulant la fonction de GSK3β dans les lésions hépatiques médiées par l'APAP.

Pour générer des souris Peli3−/− KO, un vecteur knock-out conditionnel ciblant le gène Peli3 a été construit à l'aide d'un système de recombinaison45 (Fig. 1a supplémentaire). Un fragment d'ADN génomique de 5,9 kb contenant l'exon 2 de Peli3 a été inséré dans le plasmide pLMJ235. La séquence loxP et la cassette frt-loxP-Neo-frt-loxP, qui a un marqueur de sélection positif (gène de résistance à la néomycine), ont été insérées respectivement à 117 pb en amont et 304 pb en aval de l'exon 2. Le vecteur de ciblage linéarisé contre le gène Peli3 a été initialement électroporé dans 2 × 107 ESC de souris J1. Environ trois cents colonies résistantes au G418 et au 1-(2-désoxy-2-fluoro-1-β-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil (FIAU) ont été prélevées au hasard, et ces clones ont été criblés par des analyses génomiques par Southern blot en utilisant sondes externes. Des ESC ciblés ont été injectés dans des blastocystes de la souche C57BL/6 (B6). La culture ESC et les injections de blastocystes ont été réalisées en utilisant des méthodes standard. Des chimères mâles ont été croisées avec des femelles B6 pour établir la souche Peli3+/3f dans un fond hybride 129/B6. Des souris Peli3+/3f ont été croisées avec des souris β-actine-Cre pour générer une souche de souris avec l'allèle nul Peli31f46, dans laquelle l'exon 2 a été supprimé. Pour générer des souris Peli3 KO avec le fond C57BL/6, des souris Peli3 KO avec le fond hybride ont été rétrocroisées avec des souris C57BL/6 pendant plus de dix générations. Les génotypes de souris KO de type sauvage et Peli3-/- ont été analysés par PCR à l'aide des amorces indiquées (Fig. 1b supplémentaire). L'expression de l'ARNm Peli3 chez les souris Peli3-/- KO a également été confirmée par RT‒PCR quantitative en temps réel (qRT‒PCR) avec les amorces décrites dans le tableau supplémentaire 1.

Des cellules de rein embryonnaire humain 293 (HEK293) ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Les cellules HEK293 ont été maintenues dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Thermo Fisher Scientific), 10 unités/ml de pénicilline et 10 mg/ml de streptomycine (Thermo Fisher Scientifique). Les cellules HEK293 ont été testées en routine pour la contamination par les mycoplasmes par PCR. Des hépatocytes primaires de souris ont été incubés dans du milieu M199 (Sigma-Aldrich) avec 10 % de FBS, 10 unités/ml de pénicilline, 10 mg/ml de streptomycine, 23 mM HEPES et 10 nM de dexaméthasone (Sigma-Aldrich). L'acétaminophène (APAP) a été acheté chez Sigma-Aldrich. Les plasmides ont été transfectés de manière transitoire dans des cellules HEK293 à l'aide de polyéthylèneimine (PEI). La lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) a été utilisée pour la transfection dans des cellules hépatocytaires primaires de souris.

Des souris mâles Peli3−/− KO (âgées de 8 à 9 semaines) et leurs congénères de type sauvage ont été utilisées pour l'ensemble des expériences, ont été hébergées dans une installation exempte d'agents pathogènes, ont maintenu un rythme d'horloge circadien de 12 h/12 ​​h et ont été nourries nourriture standard. Pour établir un modèle de lésion hépatique induite par l'APAP, des souris ayant jeûné pendant 14 h en présence d'eau sans nourriture uniquement ont reçu par voie orale 500 mg/kg d'APAP. Avant son administration, l'APAP a été dissoute dans de l'eau distillée à 55 °C et refroidie à 37 °C. Comme témoin, de l'eau distillée a été administrée par voie orale aux souris. Après l'administration d'APAP, la survie des souris a été contrôlée aux temps indiqués. Le tissu hépatique et le sérum sanguin ont été prélevés 24 h après le traitement APAP pour d'autres expériences. La construction d'adénovirus recombinants exprimant un contrôle ARNi non spécifique (shCON) et des shARN spécifiques à Peli3 (shPeli3 #3 et shPeli3 #4) et les expérimentations animales associées ont été réalisées comme décrit précédemment47. Les séquences ARNi spécifiques contre l'ARNm Peli3 endogène utilisées dans les adénovirus recombinants sont décrites dans le tableau supplémentaire 2. Cette étude a été examinée et approuvée par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de la faculté de médecine de l'Université Sungkyunkwan (SUSM), qui est un Établissement accrédité par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation de Laboratory Animal Care International (AAALAC International) et conforme aux directives de l'Institute of Laboratory Animal Resources (ILAR). Dans toutes les expériences animales, des souris ont été sélectionnées au hasard pour la génération du modèle de lésion hépatique induite par l'APAP.

Les plasmides d'expression Pellino3a et Pellino3b humains marqués HA ont été décrits précédemment48. En utilisant HA-hPellino3a et HA-hPellino3b comme matrices pour la PCR avec des amorces spécifiques, les ADNc Pellino3a et Pellino3b ont été sous-clonés dans les sites EcoRI et XhoI du vecteur pcDNA-Flag (Thermo Fisher Scientific) ou les sites XhoI et KpnI du pCS3+MTBX vector, qui a été gracieusement fourni par le Dr CY Choi (Université Sungkyunkwan, Corée), et ce processus a donné Flag-hPellino3a et Flag-hPellino3b et 6xMyc-hPellino3a et 6xMyc-hPellino3b, respectivement. L'ADNc de Pellino3 de souris pleine longueur a été amplifié à partir d'hépatocytes primaires de souris et sous-cloné dans les sites EcoRI et XhoI du vecteur pcDNA-Flag ou dans les sites XhoI et SalI du vecteur pCS3 + MTBX, ce qui a donné Flag-mPellino3 ou Myc-mPellino3. L'ADNc GSK3β humain complet a été amplifié par PCR à partir d'un plasmide précédemment décrit codant pour HA-GSK3β49, puis sous-cloné dans les sites EcoRI et SalI du vecteur pCS3 + MTBX ou les sites EcoRI et NcoI du vecteur pCS5-Flag pour donner 6xMyc- GSK3β ou Flag-GSK3β. La GSK3β de souris pleine longueur a été sous-clonée dans les sites EcoRV et Ncol du vecteur pCS5-Flag, ce qui a donné Flag-mGSK3β. Les ADNc JNK1, JNK2 et MLK3 pleine longueur ont été achetés auprès d'Addgene (Watertown, MA, USA) et sous-clonés dans les sites EcoRV et XhoI du vecteur pcDNA-Flag après amplification par PCR. Les ADNc MKK4 et MKK7 humains pleine longueur ont été amplifiés à partir des ADNc des cellules HEK293 et ​​sous-clonés dans les sites BamHI/XhoI et EcoRI/XhoI du vecteur pcDNA-Flag, ce qui a donné Flag-MKK4 et Flag-MKK7, respectivement. Des mutants catalytiquement inactifs des ADNc de Pellino3a et Pellion3b humains et de Pellino3 de souris ont été générés à l'aide du kit QuikChange Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA, USA) en utilisant Flag-hPellino3a, Flag-hPellino3b et Flag-mPellino3 comme modèles, ce qui a donné Flag-hPellino3a -CI, Drapeau-hPellino3b-CI et Drapeau-mPellino3-CI. Le mutant GSK3β-S9A de souris a également été généré à l'aide du kit QuikChange Mutagenesis, ce qui a donné Flag-mGSK3β-S9A. Les plasmides codant pour l'ubiquitine étiquetée HA (HA-Ubi) et l'ubiquitine étiquetée His (His-Ubi) ont déjà été décrits47,48. Les parties générées par PCR de toutes les constructions de cette étude ont été vérifiées par séquençage. Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification par PCR et la mutagenèse dirigée dans cette étude sont décrites dans le tableau supplémentaire 3.

Des tests d'immunoblot et d'immunoprécipitation ont été effectués comme décrit précédemment49. Les noms de société, les numéros de catalogue, les espèces et les taux de dilution des anticorps utilisés pour l'immunotransfert et l'immunoprécipitation sont décrits dans le tableau supplémentaire 4. L'isolement de la synthèse totale d'ARN et d'ADNc a été effectué comme décrit précédemment49. Les séquences des amorces pour les ARNm Peli3, Tnf et Ifn1 utilisées pour la qRT‒PCR en temps réel sont décrites dans le tableau supplémentaire 1. La qRT‒PCR en temps réel a été réalisée à l'aide d'un appareil de PCR en temps réel CFX Connect et d'iQ SYBR Green SuperMix ( Bio-Rad, Hercules, CA, USA) pour mesurer l'expression des gènes dans les conditions suivantes : 40 cycles de 95 °C pendant 10 s, 62 °C pendant 10 s et 72 °C pendant 30 s. Toutes les réactions ont été répétées indépendamment au moins trois fois pour assurer la reproductibilité.

Toutes les expériences, y compris les immunoblots, ont été réalisées avec trois réplicats biologiques indépendants. Les résultats sont exprimés en moyenne ± ET. La signification statistique a été calculée par ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle à l'aide du logiciel GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA). P < 0,05 a été considéré comme indiquant une signification statistique.

Détails de l'analyse histologique, de l'infiltration des neutrophiles, du test TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transférase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling), de l'isolement primaire des hépatocytes, des mesures du glutathion et des espèces réactives de l'oxygène, du 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)- Les dosages du bromure de 2,5-diphényltétrazolium (MTT) et de l'activité lysosomale, le fractionnement des extraits cytosoliques et mitochondriaux, l'immunotransfert, l'immunoprécipitation, le dosage d'ubiquitination in vitro, les dosages ELISA et myéloperoxydase (MPO) sont fournis dans les informations supplémentaires.

Bien que la protéine Pellino3, avec son activité intrinsèque de ligase E3, soit impliquée dans l'activation des MAPK, telles que JNK et p3843,44, son rôle physiopathologique dans les lésions hépatiques induites par l'APAP est inconnu. Pour traiter la fonction exacte de Pellino3 dans les lésions hépatiques induites par l'APAP, nous avons généré des souris Peli3 − / − KO corps entier (Fig. 1a supplémentaire). L'inactivation du gène Peli3 a été confirmée par génotypage et RT‒PCR quantitative en temps réel, car tous les anticorps disponibles dans le commerce contre la protéine Pellino3 ne pouvaient pas détecter l'expression endogène de Pellino3 (Fig. 1b, c supplémentaires). Des souris Peli3−/− KO corps entier et des souris de type sauvage (Peli3+/+ WT) ont reçu par voie orale une forte dose d'APAP (500 mg/kg) et leurs taux de survie ont été observés pendant 4 jours. Au jour 4, les souris Peli3−/− KO (n = 15) ont montré un taux de survie de 80 %, tandis que les souris Peli3+/+ WT (n = 15) ont montré un taux de survie de 20 % (P < 0,05) (Fig. 1a). De plus, les niveaux de biomarqueurs de lésions hépatiques, à savoir l'alanine aminotransférase (ALT) sérique et l'aspartate aminotransférase (AST), ont été significativement diminués chez les souris Peli3−/− KO par rapport aux souris Peli3+/+ WT (Fig. 1b). Conformément à ces résultats, la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) des tissus hépatiques a indiqué que la mort des cellules nécrotiques centrolobulaires et l'infiltration des cellules immunitaires, qui sont induites par le traitement APAP chez les souris Peli3+/+ WT, étaient significativement réduites chez les souris Peli3−/− KO ( Fig. 1c). Le test TUNEL des souris Peli3−/− KO a soutenu la réduction de la mort cellulaire dans le foie (Fig. 1d, e). De plus, les niveaux de cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-1β, l'IL-6 et le TNFα ont été significativement réduits lors du traitement par APAP dans le sérum des souris Peli3−/− KO par rapport aux souris Peli3+/+ WT (Fig. 1f– h). Conformément à la diminution de l'expression de ces cytokines, l'immunohistochimie des marqueurs neutrophiles Ly6G et Ly6C et les dosages MPO ont montré une infiltration réduite des neutrophiles dans le foie des souris Peli3 − / − KO (Fig. 1i, j).

a Des souris Peli3-/- et des compagnons de portée de type sauvage (WT) ont reçu par voie orale 500 mg/kg d'APAP, et la survie globale des souris a été surveillée aux moments indiqués. n = 15 par groupe. Les données ont été analysées statistiquement par le test du log-rank (**P < 0,05 par rapport au groupe contrôle, souris Peli3+/+ WT). b Les taux sériques d'ALT et d'AST ont été mesurés 24 h après l'administration orale d'APAP. n = 5 par groupe. Sham indique l'administration d'eau distillée (DW). Les données ont été analysées statistiquement par ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Bonferroni (** P < 0,01 et **** P < 0,0001 par rapport au groupe indiqué). Les barres représentent les moyennes ± SD. c Coloration H&E des foies isolés de souris Peli3−/− et WT 24 h après l'administration orale d'APAP. Barres d'échelle, 100 μM (images originales), 500 μm (encarts agrandis). d Dosages TUNEL des foies de souris Peli3−/− et WT à 24h après administration orale. Barres d'échelle, 100 μm (images originales), 500 μm (encarts agrandis). e Au moins cinq points chauds dans une section des tests TUNEL ont été sélectionnés et le nombre moyen a été déterminé. Les données ont été analysées statistiquement par ANOVA à deux facteurs suivi du test de comparaison multiple de Sidak (** P < 0,01 par rapport au groupe indiqué). Les barres représentent les moyennes ± SD. ELISA f–h de cytokines pro-inflammatoires dans les sérums de souris Peli3−/− KO et Peli3+/+ WT à 24 h après l'administration orale d'APAP. n = 3 par groupe. Les données ont été analysées statistiquement par ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Bonferroni (** P < 0,01, *** P < 0,001 et **** P < 0,0001 par rapport au groupe indiqué). i Immunohistochimie des marqueurs neutrophiles Ly6G/Ly6C dans des coupes de tissu hépatique de souris Peli3−/− et WT 24 h après l'administration orale d'APAP. Barres d'échelle, 100 μm. j Activités myéloperoxydase dans les lysats hépatiques obtenus à partir de souris Peli3−/− et WT 24 h après l'administration orale d'APAP. n = 5 par groupe. Les données ont été analysées statistiquement par ANOVA à deux facteurs suivi du test de comparaison multiple de Bonferroni (***P < 0,001 par rapport au groupe indiqué). Les barres représentent les moyennes ± SD. En (c), (d) et (i), les images présentées sont représentatives de trois expériences indépendantes.

Pour démontrer un rôle spécifique aux hépatocytes du gène Peli3 dans les lésions hépatiques induites par l'APAP, nous avons généré des souris présentant une déplétion aiguë spécifique du foie de l'ARNm de Peli3 en injectant deux adénovirus exprimant différents shARN contre l'ARNm de Peli3 (Ad-shPeli3 #3 et Ad-shPeli3 #4) via la veine caudale. Comme contrôle négatif, nous avons utilisé un adénovirus exprimant un shRNA non spécifique (Ad-shCON). L'analyse quantitative en temps réel par RT‒PCR (qRT‒PCR) a montré une régulation négative significative de l'ARNm de Peli3 dans les hépatocytes primaires exprimant des adénovirus recombinants avec chaque shARN contre l'ARNm de Peli3 par rapport aux adénovirus témoins (Fig. 2a). Les Nice ont été infectés par ces adénovirus pendant 72 h puis ont jeûné pendant 14 h, puis 500 mg/kg d'APAP ont été administrés par voie orale. La coloration H&E 24 h après le traitement APAP a indiqué que les lésions hépatiques induites par le traitement APAP, telles que la mort des cellules nécrotiques centrolobulaires, étaient significativement réduites dans le foie des souris Peli3 KD (Ad-shPeli3 # 3 et # 4) (Fig. 2b). Les tests TUNEL ont également indiqué une réduction de la mort cellulaire dans le foie des souris Peli3 KD (Fig. 2c). De plus, les taux sériques d'ALT et d'AST étaient significativement diminués chez les souris Peli3 KD par rapport aux souris témoins (Fig. 2d). Ces résultats suggèrent fortement que le déficit en Peli3 dans les hépatocytes diminue les lésions hépatiques induites par l'APAP.

a Des souris ont été infectées par des adénovirus exprimant le shRNA ciblant l'ARNm de Peli3 (Ad-shPeli3 #3 et Ad-shPeli3 #4) par la veine caudale. Des adénovirus exprimant un shRNA non spécifique (Ad-shCON) ont été utilisés comme contrôle. L'inactivation de l'ARNm de Peli3 dans les hépatocytes à 96 h post-infection de ces virus a été confirmée par analyse qRT‒PCR. n = 3 par groupe. Les données ont été analysées statistiquement par ANOVA à deux facteurs suivi du test de comparaison multiple de Sidak (***P < 0,001 par rapport au groupe indiqué). Les barres représentent les moyennes ± SD. b, c Les souris ont été infectées avec des adénovirus recombinants, et 72 h plus tard, les souris ont été mises à jeun pendant 14 h puis administrées par voie orale à 500 mg/kg d'APAP. La coloration H&E (b) et les tests TUNEL (c) de foies isolés de Peli3 knockdown (Ad-shPeli3 #3 et Ad-shPeli3 #4) et de souris témoins (Ad-shCON) 24 h après l'administration orale d'APAP ont été réalisés. Barres d'échelle, 100 μm (images originales) et 500 μm (encarts agrandis). Les images sont représentatives de trois expériences indépendantes. d Les taux sériques d'ALT et d'AST ont été mesurés 24 h après l'administration orale d'APAP. n = 5 par groupe. Les données ont été analysées statistiquement par ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Bonferroni (** P < 0,01, *** P < 0,001 et **** P < 0,0001 par rapport au groupe indiqué). Les barres représentent les moyennes ± SD. b–d Sham indique l'administration d'eau distillée (DW).

Puisqu'il a été démontré que Pellino3 est nécessaire à la régulation de diverses voies de signalisation inflammatoires, telles que la signalisation des récepteurs de type Toll, la signalisation NOD2 et les voies de signalisation TNF39,40,41,42, nous avons ensuite examiné l'expression de gènes cibles tels que TNFα et l'interféron de type I dans les hépatocytes pour comprendre si Pellino3 médie l'hépatotoxicité de l'APAP par la régulation des mêmes gènes cibles. Bien que le déficit en Peli3 inhibe l'expression du TNFα induite par le ligand NOD2 dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse et augmente l'expression de l'IFNβ induite par le poly(I:C)39,41, le déficit en Peli3 dans les hépatocytes n'a pas entraîné de différences significatives dans l'expression de ARNm TNFα et IFNβ dans le cadre du traitement APAP (Fig. 2a, b supplémentaires). En revanche, l'analyse qRT‒PCR d'extraits de foie entier a indiqué que les niveaux d'expression du TNFα et de l'IFNβ lors du traitement par APAP étaient diminués chez les souris Peli3−/− KO par rapport aux souris Peli3+/+ WT (Fig. 2c, d supplémentaires). Cet écart semble être dû aux caractéristiques des extraits de foie entier qui comprennent des cellules immunitaires et des hépatocytes. Par conséquent, il est possible que le rôle mécaniste de Pellino3 dans l'hépatotoxicité APAP soit distinct de son rôle dans les voies de signalisation inflammatoires. Cependant, il convient de noter que les niveaux d'expression d'IFNβ dans le contexte du traitement APAP sont opposés à une découverte précédente concernant la signalisation NOD239, ce qui suggère la possibilité que Pellino3 contribue à l'hépatotoxicité APAP par un mécanisme qui n'a pas été identifié sur la base des connaissances actuelles. concernant Pellino3.

Nous avons ensuite cherché à savoir si l'épuisement de Peli3 après le début d'une surdose d'APAP avait des effets thérapeutiques. À cette fin, nous avons d'abord examiné les niveaux d'expression de l'ARNm de Peli3 dans les hépatocytes primaires pendant le traitement APAP. L'analyse qRT‒PCR en temps réel a indiqué que l'expression de Peli3 dans les hépatocytes était peu affectée par le traitement APAP à des moments précoces et tardifs (Fig. 3a). Pour déterminer les moments auxquels l'adénovirus recombinant exprimant l'ARNsh contre l'ARNm de Peli3 réduit les niveaux d'ARNm endogène de Peli3, des souris Peli3+/+ WT ont reçu une injection d'adénovirus recombinants (Ad-shPeli3 #3) via la veine caudale. Après isolement des hépatocytes primaires aux moments indiqués, l'expression de l'ARNm de Peli3 a été analysée par qRT‒PCR. Bien que l'expression endogène de l'ARNm de Peli3 n'ait pas été affectée 24 h après l'injection des virus Ad-shPeli3 #3, une réduction significative a été initialement détectée 72 h après l'injection (Fig. 3b). Sur la base de ces résultats, des souris WT ont été infectées par des adénovirus recombinants, ont jeûné pendant 14 h et ont reçu par voie orale 500 mg / kg d'APAP, et leur survie a ensuite été observée (Fig. 3c). L'épuisement de Peli3 par les adénovirus recombinants a augmenté de manière significative les taux de survie à 72 h et 96 h après le début du surdosage d'APAP par rapport à ceux des souris WT injectées avec des adénovirus témoins (Ad-shCON) (Fig. 3c). Ces résultats suggèrent que Peli3 KD pourrait avoir un potentiel thérapeutique dans le traitement des lésions hépatiques induites par l'APAP.

a L'expression de l'ARNm de Peli3 dans les hépatocytes primaires normaux aux moments indiqués après le traitement par APAP a été confirmée par analyse qRT‒PCR. b La réduction de l'expression de l'ARNm de Peli3 dans les hépatocytes primaires infectés par des adénovirus recombinants exprimant le shRNA spécifique de Peli3 (Ad-shPeli3 #3) aux temps indiqués a été confirmée par analyse qRT‒PCR. a, b Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes et analysées statistiquement par ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Sidak (***P < 0,001 par rapport au groupe indiqué). ns ; insignifiant. Les barres représentent les moyennes ± SD. c Des souris Peli3+/+ WT ont été infectées par des adénovirus recombinants exprimant des shARN spécifiques de Peli3 (Ad-shPeli3 #3 et Ad-shPeli3 #4) ou des adénovirus témoins exprimant des shARN non spécifiques (Ad-shCON) et ont ensuite été mises à jeun pendant 14 h. L'APAP (500 mg/kg) a été administré par voie orale et la survie globale des souris a été surveillée aux moments indiqués. n = 14 ou 15 par groupe. Les données ont été analysées statistiquement par le test du log-rank (**P < 0,05 par rapport au groupe témoin, Ad-shCON).

Étant donné que le déficit en Peli3 diminue les lésions hépatiques induites par l'APAP, il est possible que Pellino3 affecte le métabolisme de l'APAP. Pour confirmer cette possibilité, nous avons étudié l'expression du gène CYPE21, qui code pour le cytochrome hépatique P450 2E1 métabolisant l'APAP. L'analyse par immunoblot a indiqué que l'expression du gène CYP2E1 dans les hépatocytes Peli3 - / - KO était similaire à celle des hépatocytes Peli3 + / + WT, indiquant que le déficit en Peli3 n'affecte pas le métabolisme de l'APAP (Fig. 4a). Nous avons ensuite examiné les niveaux de GSH dans le foie des souris Peli3−/− KO par rapport aux souris Peli3+/+ WT, car la déplétion en GSH est un composant majeur de l'hépatotoxicité induite par l'APAP2. À cette fin, nous avons isolé des hépatocytes primaires de souris Peli3+/+ WT et Peli3−/− KO et les avons ensuite traités avec de l'APAP 20 mM pendant 2 h. Comme prévu, les niveaux totaux de GSH, qui comprenaient à la fois le glutathion oxydé (GSSG) et le glutathion réduit (GSH), ont diminué dans les hépatocytes primaires des souris Peli3 + / + WT lors du traitement APAP (Fig. 4b). Cependant, les niveaux totaux de GSH chez les souris Peli3 - / - KO n'ont pas été réduits autant que ceux des souris Peli3 + / + WT (Fig. 4b). Conformément à ces résultats, les niveaux de glutathion oxydé (GSSG) et le rapport GSSG sur GSH ont été augmentés dans les hépatocytes primaires des souris Peli3 + / + WT et significativement diminués chez les souris Peli3 − / − KO (Fig. 4c, d). Ces résultats ont indiqué que le déficit en Peli3 entraîne une réduction de la déplétion en GSH dans les lésions hépatiques induites par l'APAP.

a L'expression de la protéine du cytochrome hépatique P450 2E1 (CYP2E1) dans les hépatocytes primaires des souris Peli3−/− KO et Peli3+/+ WT a été surveillée pendant le traitement avec 20 mM d'APAP pendant les durées indiquées. b–d Les niveaux de glutathion total (b : GSH + GSSG) et de glutathion oxydé (c : GSSG) et le rapport GSSG sur GSH (d) dans les hépatocytes primaires des souris Peli3−/− et WT ont été mesurés à 2 h après traitement APAP 20 mM. n = 3 par groupe. e Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les hépatocytes primaires ont été mesurées par cytométrie en flux à l'aide de H2-DCFDA et quantifiées. n = 3 par groupe. f Les hépatocytes primaires des souris Peli3-/- KO et Peli3+/+ WT ont été incubés avec le colorant rouge MitoSOX, traités avec de l'APAP 20 mM pendant 4 h et analysés par cytométrie en flux pour la fluorescence MitoSOX. n = 3 par groupe. g L'expression de la superoxyde dismutase 2 (SOD2) dans les hépatocytes primaires des souris Peli3−/− KO et Peli3+/+ WT a été surveillée pendant le traitement avec 20 mM d'APAP pendant les durées indiquées. h La phosphorylation de l'histone H2AX dans les hépatocytes primaires obtenus à partir de deux souris indépendantes Peli3−/− KO et Peli3+/+ WT a été suivie par immunotransfert aux temps indiqués. (i) Pour l'évaluation de la fonction mitochondriale, des tests MTT d'hépatocytes primaires de souris Peli3−/− KO et Peli3+/+ WT collectés après un traitement à l'APAP pendant 4 h ont été réalisés. n = 3 par groupe. j Un test d'activité lysosomale utilisant un substrat auto-extinguible a été réalisé avec des hépatocytes primaires de souris Peli3−/− KO et Peli3+/+ WT après traitement avec APAP pendant 8 h. n = 3 par groupe. b–f, i, j Les données ont été analysées statistiquement par ANOVA à deux facteurs suivi du test de comparaison multiple de Bonferroni (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 et ****P < 0,0001 par rapport au groupe indiqué). Les barres représentent les moyennes ± SD. Les images présentées en (a), (g) et (h) sont représentatives de trois expériences indépendantes.

Étant donné que la déplétion en GSH dans l'hépatotoxicité APAP est liée à la génération de ROS, nous avons ensuite mesuré les niveaux de ROS dans les hépatocytes primaires des souris Peli3+/+ WT et Peli3−/− KO lors d'un traitement APAP 20 mM par analyse de cytométrie en flux à l'aide du colorant H2-DCFDA. . 4 h après le traitement APAP, les niveaux de ROS ont augmenté dans les hépatocytes des souris Peli3 + / + WT et ont diminué de manière significative dans ceux des souris Peli3 - / - KO (Fig. 4e). En plus des ROS intracellulaires, la coloration MitoSOX a indiqué que les niveaux de ROS mitochondriaux étaient significativement réduits lors du traitement par APAP dans les hépatocytes Peli3 − / − KO par rapport aux hépatocytes Peli3 + / + WT (Fig. 4f). De plus, l'expression de la superoxyde dismutase mitochondriale 2 (SOD2), qui agit comme une protéine piégeuse pour éliminer les ROS, a été maintenue dans les hépatocytes primaires traités à l'APAP de souris Peli3−/− KO, alors qu'une expression réduite a été observée chez les souris Peli3+/+ WT (Fig. 4g). Étant donné que le stress oxydatif et nitrosatif dans l'hépatotoxicité APAP est connu pour induire des dommages à l'ADN et un dysfonctionnement mitochondrial50, nous avons ensuite examiné la phosphorylation de l'histone H2AX (pH2AX), une caractéristique des cassures double brin (DSB), dans les hépatocytes obtenus à partir de Peli3+/+ WT et souris Peli3-/- KO après traitement APAP. La phosphorylation de l'histone H2AX a été significativement diminuée chez les souris Peli3−/− KO (Fig. 4h). Pour évaluer la fonction mitochondriale chez les souris Peli3−/− KO, nous avons évalué l'activité de la déshydrogénase mitochondriale par le test MTT. La fonction mitochondriale dans les hépatocytes Peli3 + / + WT, mais pas dans les hépatocytes Peli3 − / − KO, était significativement altérée après le traitement APAP (Fig. 4i). Ensuite, à l'aide d'un substrat auto-trempé, nous avons quantifié l'activité enzymatique lysosomale in situ dans les hépatocytes primaires des souris Peli3−/− KO et Peli3+/+ WT après traitement avec APAP pendant 8 h. L'activité enzymatique lysosomale a été augmentée par l'APAP dans les hépatocytes Peli3 + / +, reflétant les lésions lysosomales causées après le traitement par APAP, alors que l'activité enzymatique a été réduite dans les hépatocytes Peli3 − / − (Fig. 4j). Ces résultats fournissent des preuves solides montrant que la déficience en Peli3 contribue à la suppression des dommages mitochondriaux et lysosomal en diminuant le stress oxydatif lors du traitement APAP.

Ensuite, nous avons exploré la fonction moléculaire de la protéine Pellino3 dans les lésions hépatiques induites par l'APAP. Pour trouver un indice, nous avons d'abord examiné l'interaction de la protéine Pellino3 avec diverses kinases impliquées dans les lésions hépatiques induites par l'APAP, car il a été démontré que l'activité de Pellino3 conduit à l'activation de JNK43. Il existe deux formes de protéines Pellino3 chez l'homme produites par épissage alternatif, Pellino3a et Pellino3b43, alors qu'une seule forme de Pellino3 se trouve chez la souris. Les protéines Pellino3 humaines et Pellino3 de souris utilisées dans cette étude sont désignées respectivement hPellino3 et mPellino3.

Des tests de co-immunoprécipitation ont révélé que la protéine Pellino3a humaine, qui est la forme la plus longue, se liait fortement à GSK3β et MLK3, qui sont des MAP3K, mais se liait faiblement aux JNK (Fig. 5a). De même, hPellino3b, la forme la plus courte, également liée à GSK3β et MLK3 (Fig. 3a, b supplémentaires). Ces résultats nous ont incités à rechercher si la protéine Pellino3 humaine avec son activité E3 ligase induit l'ubiquitination de GSK3β et MLK3. Les plasmides codant pour HA-GSK3β et His-Ubi ont été cotransfectés dans des cellules HEK293 en présence de Flag-hPellino3, Flag-hPellino3b de type sauvage ou de mutants catalytiquement inactifs dans lesquels les résidus de cystéine dans le site actif de hPellino3a ou hPellino3b ont été mutés en alanines, et des essais de pull-down Ni-NTA ont ensuite été effectués. La polyubiquitination de GSK3β a été observée avec les deux protéines Pellino3 humaines, mais pas avec les mutants catalytiquement inactifs de hPellino3a et hPellino3b (Fig. 5b). De plus, la polyubiquitination de la protéine GSK3β a également été trouvée avec Flag-mPellino3 de type sauvage mais pas avec le mutant catalytiquement inactif de mPellino3 (Fig. 5c). Contrairement à GSK3β, la protéine MLK3 n'était pas polyubiquitinée par hPellino3a et hPellino3b (Fig. 4 supplémentaire). Ces résultats ont indiqué la possibilité que les Pellino3 humains et murins régulent spécifiquement les lésions hépatiques induites par l'APAP par la polyubiquitination de GSK3β. Bien que nous n'excluions pas la possibilité que Pellino3 puisse moduler l'hépatotoxicité de l'APAP par interaction avec MLK3, nous nous sommes concentrés sur l'identification du mécanisme moléculaire des lésions hépatiques induites par l'APAP sur la base de la polyubiquitination médiée par Pellino3 de GSK3β. Pour confirmer davantage l'interaction endogène de Pellino3 avec GSK3β dans les hépatocytes primaires de souris, nous avons effectué des tests d'immunoprécipitation. Cependant, nous n'avons pas réussi à confirmer l'interaction endogène entre les deux protéines car tous les anticorps disponibles dans le commerce contre Pellino3 n'ont pas détecté l'expression endogène de Pellino3. Malgré ces problèmes, nous avons transfecté le plasmide codant pour Flag-mPellino3 dans des hépatocytes primaires Peli3−/− KO. Après traitement APAP pendant les durées indiquées, des tests d'immunoprécipitation ont été effectués avec un anticorps anti-Flag. La protéine Flag-Pellino3 exprimée de manière ectopique dans les hépatocytes Peli3 − / − KO a spécifiquement interagi avec la GSK3β endogène 2 h après le traitement APAP (Fig. 5d).

a Un plasmide codant pour HA-hPellino3 a été cotransfecté dans des cellules HEK293 avec les plasmides marqués Flag indiqués. Les lysats cellulaires ont été immunoprécipités (IP) avec des anticorps anti-Flag et ensuite immunotransférés (IB) avec des anticorps anti-HA et anti-Flag. Les lysats cellulaires totaux (TCL) ont été immunoblottés avec les anticorps indiqués. b Après qu'un plasmide codant pour His-Ubi de type sauvage a été cotransfecté avec HA-GSK3β dans des cellules HEK293 en l'absence ou en présence de Flag-hPellino3a, Flag-hPellino3a-CI, Flag-hPellino3b et Flag-hPellino3b-CI, Ni-NTA- des essais pull-down médiés ont été effectués. Les TCL ont été immunoblottés avec les anticorps indiqués. c Les plasmides codant pour 6xMyc-GSK3β et HA-Ubi ont été cotransfectés dans des cellules HEK293 avec un plasmide codant pour Flag-mPellino3 de type sauvage ou un mutant catalytiquement inactif (CI) de Flag-mPellino3 (Flag-mPellino3-CI). L'ubiquitination de GSK3β a été examinée par immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps anti-Myc dans des conditions dénaturantes de SDS à 1 % et par immunotransfert avec un anticorps anti-HA. Les TCL ont été immunoblottés avec les anticorps indiqués. d Un plasmide codant Flag-mPellino3 a été transfecté dans des hépatocytes Peli3-/- KO puis traité avec 20 mM pendant les durées indiquées. Les lysats cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-Flag puis immunoblottés avec un anticorps anti-GSK3β. Les TCL ont été immunoblottés avec les anticorps indiqués. e Pour l'ubiquitination de la protéine GSK3β endogène, des hépatocytes primaires de souris Peli3−/− et WT ont été traités avec 20 mM d'APAP pendant 2 h ou 4 h. Les lysats cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-GSK3β dans des conditions dénaturantes de SDS à 1 %, puis immunotransférés avec un anticorps anti-ubiquitine (FK2-HRP). Les TCL ont été immunoblottés avec les anticorps indiqués. Comme contrôle négatif, les lysats cellulaires ont été immunoprécipités avec un anticorps anti-IgG. f Un plasmide codant pour l'ubiquitine de type sauvage (HA-Ubi-WT) ou des mutants d'ubiquitine qui ne médient que la polyubiquitination liée à K48 (HA-Ubi-K48) ou à K63 (HA-Ubi-K63) a été transfecté dans des cellules HEK293 avec 6xMyc -GSK3β et Flag-hPellino3a aux combinaisons indiquées. Les lysats cellulaires ont été immunoprécipités (IP) avec un anticorps anti-Myc puis immunotransférés (IB) avec un anticorps anti-HA. Les TCL ont été immunoblottés avec les anticorps indiqués. g Un plasmide codant pour HA-GSK3β a été cotransfecté dans des cellules HEK293 avec une expression accrue dose-dépendante de Flag-hPellino3a. Les lysats cellulaires ont été immunotransférés avec les anticorps indiqués. Dans tous les immunoblots, l'expression de la β-actine a été utilisée comme contrôle de chargement. Les images de cette figure sont représentatives d'au moins trois expériences indépendantes.

Ensuite, nous avons examiné si la polyubiquitination de la GSK3β endogène est régulée par Pellino3 afin de vérifier l'importance de la polyubiquitination de la GSK3β médiée par Pellino3 dans les lésions hépatiques induites par l'APAP. Les hépatocytes ont été isolés à partir de souris Peli3+/+ WT et Peli3−/− KO, traités avec APAP pendant les temps indiqués et immunoprécipités avec un anticorps anti-GSK3β contre la protéine GSK3β endogène dans des conditions dénaturantes de SDS à 1 %, et une polyubiquitination endogène de GSK3β a été observée par immunotransfert avec un anticorps anti-ubiquitine. Une polyubiquitination accrue de GSK3β endogène a été observée dans les hépatocytes Peli3 + / + WT jusqu'à 4 h après le traitement APAP (Fig. 5e). Cependant, la polyubiquitination de la GSK3β endogène était significativement diminuée dans les hépatocytes Peli3−/− KO (Fig. 5e). Étant donné que le processus de polyubiquitination nécessite la liaison d'une ligase E3 à un substrat spécifique, nos résultats indiquent fortement que Pellino3 est responsable de la polyubiquitination de GSK3β dans les lésions hépatiques induites par l'APAP par liaison directe à GSK3β.

Sur la base de ces découvertes, nous avons ensuite étudié le schéma de polyubiquitination de GSK3β par Pellino3 humain. L'ubiquitine de type sauvage (HA-Ubi), le mutant d'ubiquitine K48 (HA-Ubi-K48) dans lequel six résidus de lysine à l'exception de la lysine 48 sont remplacés par l'arginine, et le mutant d'ubiquitine K63 (HA-Ubi-K63) dans lequel seule la lysine 63 est laissé intact ont été cotransfectés dans des cellules HEK293 avec 6xMyc-GSK3β en l'absence ou en présence de Flag-hPellino3a. La polyubiquitination de GSK3β liée à K63 mais non à K48 a été augmentée par Pellino3 (Fig. 5f). Étant donné que la polyubiquitination liée à K63 est connue pour être impliquée dans diverses activités cellulaires, telles que la transduction du signal, le trafic de protéines, l'interaction protéine-protéine et la réparation de l'ADN, il est possible que la polyubiquitination GSK3β liée à K63 par Pellino3 influence la transduction du signal médiée par GSK3β. dans les lésions hépatiques induites par l'APAP et n'affecte pas la stabilité de la protéine GSK3β. En fait, l'expression de Pellino3 humain n'a pas affecté de manière dose-dépendante la stabilité de GSK3β, et ce processus est médié par la polyubiquitination liée à K48 (Fig. 5g).

Nos résultats actuels indiquent fortement que Pellino3 agit comme une ligase E3 pour induire la polyubiquitination de GSK3β. La GSK3β est constitutivement active dans le cytoplasme et son activité est renforcée par la phosphorylation au niveau de la tyrosine 216 ou inhibée par la phosphorylation au niveau de la sérine 9 (Ser9)53,54. Fait intéressant, le traitement APAP est connu pour augmenter la phosphorylation des formes actives et inhibées de GSK3β et provoquer la translocation des protéines GSK3β phosphorylées et totales dans les mitochondries32. Cependant, la raison pour laquelle la forme inhibée de GSK3β est améliorée dans les lésions hépatiques médiées par l'APAP et la manière dont GSK3β est transloquée dans les mitochondries ne sont pas claires.

Par conséquent, nous avons ensuite examiné comment Pellino3 module la fonction de GSK3β dans les lésions hépatiques induites par l'APAP. À cette fin, nous avons étudié la phosphorylation et la translocation mitochondriale de GSK3β dans des hépatocytes obtenus à partir de souris Peli3+/+ WT et Peli3−/− KO auxquelles on a administré de l'APAP par voie orale. Le niveau de phosphorylation à Ser9 de GSK3β était significativement diminué chez les souris Peli3 − / − KO, alors que la phosphorylation de la tyrosine 216 (Tyr216) était à peine affectée par le déficit en Peli3 (Fig. 6a). Les tests de fractionnement cytoplasmique et mitochondrial ont révélé que la translocation mitochondriale de la GSK3β totale et de la GSK3β phosphorylée à Ser9 a été initiée 1 h après le traitement APAP dans les hépatocytes Peli3 + / + WT. En revanche, la translocation mitochondriale de GSK3β et la phosphorylation au niveau de Ser9 ont été significativement réduites chez les souris Peli3 - / - KO par rapport aux souris Peli3 + / + WT (Fig. 6b). Cependant, la phosphorylation réduite de GSK3β au niveau de Ser9 dans la fraction mitochondriale des hépatocytes Peli3−/− semble être due à une diminution de la translocation mitochondriale de la GSK3β totale.

a Des lysats de foie entier isolés de souris Peli3-/- et WT aux moments indiqués après l'administration orale de 500 mg/kg d'APAP ont été immunoblottés avec les anticorps indiqués pour examiner la phosphorylation de GSK3β. b Les hépatocytes primaires isolés de souris Peli3-/- et WT ont été traités avec de l'APAP 20 mM pendant les durées indiquées, puis fractionnés en extraits cytoplasmiques et mitochondriaux. Les deux extraits ont été immunotransférés avec les anticorps indiqués contre la GSK3β phosphorylée en Ser9 et la GSK3β totale. L'expression de la tubuline et de la COX IV a été utilisée comme marqueurs cytoplasmiques et mitochondriaux et contrôles de charge, respectivement. c Les lysats de foie entier obtenus à partir de souris Peli3-/- et WT 4 h après l'administration orale de 500 mg/kg d'APAP ont été immunoblottés avec des anticorps pour détecter la phosphorylation et le niveau total de JNK. d Les hépatocytes primaires isolés de souris Peli3-/- et WT ont été traités avec 20 mM d'APAP pendant 2 h ou 4 h, puis fractionnés en extraits cytoplasmiques et mitochondriaux. Les deux extraits ont été immunotransférés avec les anticorps indiqués. e Pour les expériences de sauvetage, Flag-Pellino3 de type sauvage ou un mutant catalytiquement inactif (CI) de Pellino3 a été transfecté dans des hépatocytes primaires obtenus à partir de souris Peli3-/-. Comme témoin, un vecteur factice a été transfecté dans des hépatocytes primaires obtenus à partir de souris de type sauvage. Après que les deux ensembles d'hépatocytes aient été traités avec 20 mM d'APAP pendant 2 h, ils ont été fractionnés en extraits cytoplasmiques et mitochondriaux, puis immunoblottés avec les anticorps indiqués pour détecter la phosphorylation de GSK3β au niveau du résidu Ser9 et les niveaux totaux de GSK3β. Dans (d) et (e), la tubuline et la COX IV ont été utilisées comme marqueurs cytoplasmiques et mitochondriaux et contrôles de charge. f Les plasmides codant pour Flag-mGSK3β de type sauvage, le mutant Flag-mGSKβ-S9A et HA-Ubi ont été cotransfectés dans des cellules HEK293 avec un plasmide codant pour Myc-mPellino3 selon les combinaisons indiquées. L'ubiquitination de GSK3β a été examinée par immunoprécipitation à l'aide d'un anticorps anti-Flag et par immunotransfert avec un anticorps anti-HA-HRP. Les lysats cellulaires totaux (TCL) ont été immunoblottés avec les anticorps indiqués. g Des hépatocytes primaires de souris Peli3+/+ WT ont été transfectés avec Flag-mGSK3β de type sauvage ou le mutant Flag-mGSK3β-S9A, puis traités avec APAP pendant 8 h. Les extraits cellulaires ont été immunotransférés avec des anticorps anti-phospho-H2AX et anti-Flag. h Après que les plasmides codant HA-Ubi-WT, HA-Ubi-K48 et HA-Ubi-K63 ont été transfectés dans les hépatocytes Peli3+/+ WT et Peli3−/− KO selon les combinaisons indiquées, les cellules ont été traitées avec 20 mM d'APAP pour 2 h, et les extraits cellulaires ont été immunotransférés avec les anticorps indiqués. a, c, f, g, h L'expression de la β-actine a été utilisée comme contrôle de charge. Toutes les images d'immunoblot de cette figure sont représentatives d'au moins trois expériences indépendantes.

Ensuite, nous avons étudié l'effet du déficit en Peli3 sur l'activation de JNK dans les lésions hépatiques induites par l'APAP car il a été rapporté que l'activation de JNK est en aval de GSK3β pendant l'hépatotoxicité de l'APAP et que JNK est également transloquée dans les mitochondries27,34. Après isolement des hépatocytes de souris indépendantes Peli3+/+ WT (n = 5) et Peli3−/− KO (n = 3) auxquelles on a administré de l'APAP par voie orale, nous avons analysé la phosphorylation de JNK par immunotransfert. Lors du traitement par APAP, la phosphorylation de JNK a été augmentée chez trois souris Peli3 + / + WT indépendantes et profondément diminuée chez les souris Peli3 − / − KO (Fig. 6c). De plus, la translocation mitochondriale de JNK phosphorylée et de JNK totale du cytoplasme a été significativement réduite lors du traitement par APAP chez les souris Peli3 - / - KO par rapport aux souris Peli3 + / + WT (Fig. 6d). Semblable aux résultats trouvés pour GSK3β, la phosphorylation réduite de JNK dans la fraction mitochondriale des hépatocytes Peli3-/- semble être causée par une diminution de la translocation mitochondriale de JNK. Ces résultats impliquent collectivement que Pellino3 est un composant de signalisation en amont régulant la phosphorylation et la translocation mitochondriale de GSK3β, qui régule ensuite la phosphorylation de JNK dans le cytoplasme et la translocation mitochondriale de JNK dans les lésions hépatiques induites par l'APAP.

Nous avons ensuite effectué des expériences de sauvetage pour évaluer clairement l'importance de l'activité E3 ligase de Pellino3 dans la phosphorylation et la translocation mitochondriale de GSK3β. Les hépatocytes obtenus à partir de souris Peli3−/− KO ainsi que des hépatocytes Peli3+/+ WT ont été transfectés avec mFlag-Pellino3 de type sauvage ou un mutant catalytiquement inactif de Pellino3 (Flag-mPellino3-CI) respectivement, les hépatocytes ont été traités avec APAP pour 2 h et ensuite séparés en fractions cytoplasmiques et mitochondriales. Semblable à nos résultats précédents (Fig. 6a, b), la translocation mitochondriale de GSK3β et la phosphorylation de Ser9 ont été diminuées dans les hépatocytes Peli3 − / − KO par rapport aux hépatocytes Peli3 + / + WT (Fig. 6e; Voies 2, 4, 10, 12). Fait intéressant, l'expression ectopique de mPellino3 de type sauvage dans les hépatocytes Peli3−/− KO a restauré de manière significative la translocation mitochondriale et la phosphorylation de Ser9 de GSK3β (Fig. 6e ; Pistes 4, 6, 12, 14), alors que l'expression du mutant catalytiquement inactif de Pellino3 (Flag-mPellino3-CI) n'a pas produit cet effet (Fig. 6e; Pistes 6, 8, 14). Ces résultats suggèrent que l'activité E3 ligase de Pellino3 est cruciale pour la régulation de GSK3β dans les lésions hépatiques induites par l'APAP.

Bien que nos découvertes actuelles indiquent que la phosphorylation de GSK3β Ser9 nécessite l'activité E3 ligase de Pellino3 (Fig. 6a, b), il est possible que la phosphorylation de GSK3β à Ser9 soit nécessaire pour l'ubiquitination médiée par Pellion3 de GSK3β. Pour tester cette possibilité, nous avons examiné l'ubiquitination du mutant GSK3β-S9A, dans lequel le résidu Ser9 a été remplacé par de l'alanine. Le mutant GSK3β-S9A a été polyubiquitiné par la protéine Pellino3 de type sauvage, similaire à la GSK3β de type sauvage (Fig. 6f). Pris ensemble avec nos découvertes actuelles, ces résultats indiquent que l'ubiquitination médiée par Pellino3 de GSK3β est en amont de la phosphorylation de GSK3β Ser9, qui est essentielle pour l'hépatotoxicité de l'APAP, et la phosphorylation de GSK3β à Ser9 n'est pas une condition préalable à l'ubiquitination de GSK3β par Pellino3. En fait, l'importance de la phosphorylation de GSK3β à Ser9 dans l'hépatotoxicité APAP a été confirmée par les résultats selon lesquels l'expression ectopique du mutant GSK3β-S9A dans les hépatocytes Peli3 + / + WT n'a pas augmenté la phosphorylation de l'histone H2AX lors du traitement APAP (Fig. 6g ).

De plus, nous avons étudié l'importance de la polyubiquitination liée à K63 de GSK3β par Pellino3 dans la phosphorylation de GSK3β à Ser9 et sa translocation mitochondriale. Les plasmides codant pour le mutant d'ubiquitine K48 (HA-Ubi-K48) ou K63 (HA-Ubi-K63) ont été transfectés de manière transitoire dans des hépatocytes primaires Peli3+/+ WT ou Peli3−/− KO, et les cellules ont ensuite été traitées avec APAP pendant 2 h . En tant que contrôle, l'ubiquitine de type sauvage (HA-Ubi-WT) a également été transfectée dans des hépatocytes primaires. La phosphorylation de GSK3β au niveau de Ser9 et sa translocation mitochondriale dans les hépatocytes Peli3+/+ WT ont été fondamentalement augmentées par le traitement APAP en présence d'ubiquitine de type sauvage (HA-Ubi-WT) et du mutant d'ubiquitine K48 (HA-Ubi-K48) ( Fig. 6h et Fig. 5 supplémentaire). En revanche, l'expression du mutant d'ubiquitine K63 (HA-Ubi-K63) a encore augmenté la phosphorylation de GSK3β endogène à Ser9 et sa translocation mitochondriale par traitement APAP par rapport aux résultats obtenus avec HA-Ubi-WT et HA-Ubi-K48 ( Fig. 6h et Fig. 5 supplémentaire). Cette augmentation significative de la phosphorylation de GSK3β au niveau de Ser9 et de sa translocation mitochondriale en présence de HA-Ubi-K63 n'a pas été observée dans les hépatocytes primaires Peli3 − / − KO (Fig. 6h et Supplémentaire Fig. 5). Par conséquent, ces résultats corroborent notre découverte actuelle selon laquelle la polyubiquitination de GSK3β liée à K63 par Pellino3 est nécessaire pour la phosphorylation de GSK3β au niveau de Ser9 et la translocation mitochondriale dans les lésions hépatiques induites par l'APAP.

Bien que la physiopathologie des lésions hépatiques médiées par l'APAP et les voies de signalisation régissant cette hépatotoxicité aient été largement étudiées au cours des dernières décennies, nous n'avons pas une compréhension claire des systèmes de modification de l'ubiquitine qui régulent la modification post-traductionnelle des composants de signalisation dans le foie induit par l'APAP. blessure. Seules quelques études ont suggéré que les ligases E3 telles que le réticulum endoplasmique polytopique gp78/AMFR (récepteur du facteur de motilité autocrine), Parkin et HOIP sont impliquées dans les lésions hépatiques induites par l'APAP en utilisant des souris knock-out ou la technologie d'interférence ARN55,56,57.

Dans cette étude, nous avons démontré que la protéine Pellino3 est une nouvelle ligase d'ubiquitine E3 dans les lésions hépatiques induites par l'APAP et que la polyubiquitination de GSK3β liée à K63 par Pellino3 conduit à la phosphorylation de GSK3β à Ser9 dans le cytoplasme et la translocation mitochondriale. La GSK3β phosphorylée contribue à l'augmentation des niveaux de ROS mitochondriales, de dysfonctionnement mitochondrial et de dommages à l'ADN, ce qui entraîne finalement la mort cellulaire nécrotique (Fig. 6 supplémentaire). De plus, les découvertes selon lesquelles l'expression de l'ARNm de Peli3 est à peine affectée par le traitement APAP indiquent que l'interaction de Pellino3 avec GSK3β est plus importante que la régulation de l'ARNm de Peli3 dans l'hépatotoxicité APAP. Ainsi, il s'agit de la première étude à identifier Pellino3 comme une ligase d'ubiquitine E3 ciblant GSK3β dans les hépatocytes et à révéler son rôle physiopathologique chez des souris Peli3−/− KO auxquelles on a administré de l'APAP par voie orale.

Dans cette étude, nous avons émis l'hypothèse que Pellino3 pourrait jouer un rôle important dans les lésions hépatiques induites par l'APAP car Pellino3 a été identifié pour favoriser l'activation de c-Jun et Elk-1 et est impliqué dans diverses voies de signalisation inflammatoires en ciblant différents substrats25,43 . Ici, nous avons clairement montré une réduction des lésions hépatiques induites par l'APAP chez les souris Peli3 − / − KO du corps entier et les souris appauvries en Peli3 spécifiques aux hépatocytes. Cet effet protecteur du déficit Peli3 dans l'hépatotoxicité APAP semble être dû à des diminutions de la phosphorylation et de la translocation mitochondriale de GSK3β accompagnées de réductions de ROS mitochondriales et de dysfonctionnement et de dommages à l'ADN. En fait, de plus en plus de preuves indiquent que les changements désastreux causés par le traitement APAP nécessitent la phosphorylation de GSK3β et JNK et leur translocation mitochondriale, et GSK3β est en amont de JNK32,58. Nos découvertes actuelles avec des souris Peli3−/− KO fournissent des preuves solides montrant que l'ubiquitination médiée par Pellino3 de GSK3β dans les hépatocytes est une étape essentielle pour la phosphorylation de GSK3β lors de la translocation mitochondriale Ser9 et GSK3β, qui sont essentielles pour les dommages mitochondriaux dans l'hépatoxicité APAP. Cependant, nous ne pouvions pas exclure la possibilité que Pellino3 dans les cellules inflammatoires contribue à l'hépatotoxicité de l'APAP de manière non identifiée car il a été rapporté que Pellino3 était impliqué dans diverses voies de signalisation inflammatoires.

Bien que GSK3β ait retenu l'attention en tant que régulateur important de l'activité mitochondriale et que le traitement APAP chez la souris soit connu pour provoquer l'activation de GSK3β et la translocation mitochondriale32,58, nous ne connaissons toujours pas le mécanisme exact de la translocation mitochondriale de GSK3β dans les hépatocytes. Un indice sur la façon dont GSK3β est transloqué dans les mitochondries peut être dérivé d'expériences précédemment rapportées sur des cardiomyoblastes H9c259. Dans ces cellules, GSK3β transloque vers les mitochondries sous stress oxydatif en interagissant avec le canal anionique voltage-dépendant 2 (VDAC2) d'une manière dépendante de la phosphorylation de GSK3β à Ser959. Sur la base de cette découverte précédente, la polyubiquitination de GSK3β liée à K63 par Pellino3 peut être cruciale pour l'interaction de GSK3β avec un certain facteur sur la membrane mitochondriale dans les lésions hépatiques induites par l'APAP. Par conséquent, notre étude peut fournir des indices pour approfondir nos connaissances sur le mécanisme de la translocation mitochondriale de GSK3β lors du traitement par APAP.

Cependant, les fonctions de Pellino3 dans GSK3β sont susceptibles de s'étendre au-delà de la translocation mitochondriale de GSK3β. Comparativement aux souris Peli3+/+ WT, la phosphorylation de GSK3β Ser9 dans le cytoplasme a été significativement diminuée chez les souris Peli3−/− KO, alors qu'un changement dans la phosphorylation de la tyrosine 216 n'a pas été détecté. En général, l'activité GSK3β est connue pour être améliorée par la phosphorylation de la tyrosine 216 ou inhibée par la phosphorylation de Ser9. Cependant, le traitement APAP augmenterait la phosphorylation des formes active et inhibée de GSK3β, même si la raison n'a pas été abordée jusqu'à présent32. Étant donné que les kinases qui phosphorylent directement GSK3β à Ser9 n'ont pas été signalées, il est possible que l'activité de ligase E3 de Pellino3 régule certaines kinases qui contrôlent la phosphorylation de GSK3β à Ser9. À cet égard, il est à noter que l'expression de GSK3β et la phosphorylation de la glycogène synthase (GS), qui est le substrat de GSK3beta, ont été diminuées dans les extraits de foie de souris MLK3 KO lors du traitement APAP, ce qui implique que MLK3 est connecté à GSK3β via une boucle de rétroaction positive dans les lésions hépatiques induites par l'APAP33. Cependant, il n'y a aucune preuve directe montrant que MLK3 est une kinase qui phosphoryle GSK3β à Ser9. Compte tenu de notre découverte selon laquelle Pellino3 se lie à MLK3 indépendamment de son activité de ligase E3, il convient de rechercher si la polyubiquitination liée à K63 de GSK3β par Pellino3 favorise la phosphorylation de GSK3β au niveau de Ser9 par MLK3 ou une kinase inconnue. Sur la base d'un résumé des résultats et de ceux détaillés dans les rapports précédents, la polyubiquitination de GSK3β liée à K63 médiée par Pellino3 est étroitement liée à la phosphorylation de Ser9 de GSK3β dans le cytoplasme, et sa phosphorylation à Ser9 favorise la translocation mitochondriale de GSK3β dans l'hépatotoxicité APAP. Cette spéculation peut être en partie étayée par une découverte antérieure selon laquelle la translocation mitochondriale de GSK3β dans les cardiomyoblastes H9c2 dépend de la phosphorylation de Ser959.

De plus, nos résultats selon lesquels le déficit en Peli3 réduit la génération de ROS et les niveaux hépatiques de GSH indiquent fortement que Pellino3 pourrait être impliqué dans le stress oxydatif induit par l'APAP de manière non identifiée. Ainsi, il est possible que Pellino3 soit lié à l'expression d'enzymes antioxydantes telles que la superoxyde dismutase 2 (SOD2). Par conséquent, le mécanisme sous-jacent par lequel Pellino3 régule spécifiquement l'expression d'enzymes antioxydantes telles que SOD2 dans l'hépatotoxicité APAP devrait être un sujet d'intérêt futur.

Nos découvertes selon lesquelles Pellino3 se lie aux MAP kinases GSK3β, MLK3 et JNK1 avec différentes forces de liaison impliquent que Pellino3 peut avoir une activité d'échafaudage dans la voie de signalisation régulant l'hépatotoxicité de l'APAP. Cette spéculation serait cohérente avec la découverte précédente selon laquelle Pellino3 agit comme une protéine d'échafaudage43. De plus, notre étude a montré que l'augmentation du taux de survie des souris ayant reçu de l'APAP par voie orale est corrélée à la réduction de l'expression endogène de l'ARNm de Peli3 par des adénovirus recombinants exprimant des shARN spécifiques de Peli3, ce qui suggère que la déplétion de Peli3 après le début de l'hépatotoxicité de l'APAP est capable de réduire le foie. dommage. Cette découverte souligne l'importance de l'axe Pellino3-GSK3β sur l'initiation et la progression de l'hépatotoxicité APAP. En fait, nos résultats actuels montrent que l'ubiquitination médiée par Pellino3 de GSK3β, qui conduit à la phosphorylation de GSK3β à Ser9 et à la translocation mitochondriale de GSK3β, est essentielle pour le processus pathologique des lésions hépatiques induites par l'APAP, et que le déficit en Peli3 diminue la mitochondrie. ROS et dommages ainsi que dommages lysosomal. En conclusion, ces résultats suggèrent fortement que l'axe Pellino3-GSK3β dans les hépatocytes est crucial pour les lésions hépatiques induites par l'APAP, soulignant que le blocage de l'ubiquitination de GSK3β par Pellino3 pourrait être un schéma thérapeutique important pour le traitement de l'hépatotoxicité APAP.

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Ce travail a été soutenu par la subvention de la National Research Foundation of Korea (SRC 2017R1A5A1014560) financée par le ministère des Sciences et des TIC et en partie par une subvention (2020R1A2C3009643 à SHP) de la National Research Foundation of Korea.

Jun Hyeong Kim

Adresse actuelle : KoBio Labs, Seongnam, 13488, République de Corée

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Jaewon Lee, Jihoon Ha, Jun-Hyeong Kim.

Département des sciences biologiques, Université Sungkyunkwan, Suwon, 16419, République de Corée

Jaewon Lee, Jihoon Ha, Jun-Hyeong Kim, Dongyeob Seo, Minbeom Kim, Yerin Lee, Seong Shil Park, Jin Seok Park, Su Myung Jung, Yong-Soo Bae et Seok Hee Park

Département des sciences de la vie, Université de Corée, Séoul, 02841, République de Corée

Dahee Choi et Seung-Hoi Koo

Département de biochimie, École de médecine de l'Université Gachon, Incheon, 21999, République de Corée

Jeune Jae Lee et Suntaek Hong

Département de pharmacologie, École de médecine de l'Université Ajou, Suwon, 16499, République de Corée

Siyoung Yang

SRC Center for Immune Research on Non-lymphoid Organs, Sungkyunkwan University, Suwon, 16419, République de Corée

Siyoung Yang, Yong-Soo Bae et parc Seok Hee

Medpacto Inc., Séoul, 06668, République de Corée

Kyung-Min Yang & Seong-Jin Kim

Institut GILO, Fondation GILO, Séoul, 06668, République de Corée

Seong Jin Kim

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JL, JH et JHK ont conçu la recherche, réalisé le travail expérimental, analysé les données et rédigé le manuscrit. DS, MK, YL, SSP et JSP ont réalisé les travaux expérimentaux et analysé les données. Les DC ont généré les adénovirus recombinants. YJL et SH ont généré les souris knock-out et ont participé à la conception de l'étude. SY, KMY, SMJ, SHK et YSB ont participé à la conception de l'étude, analysé les données et coordonné l'étude. SJK et SHP ont conçu et conceptualisé la recherche, supervisé le travail expérimental, analysé les données et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Seong-Jin Kim ou Seok Hee Park.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Lee, J., Ha, J., Kim, JH. et coll. L'ablation Peli3 améliore les lésions hépatiques induites par l'acétaminophène en inhibant la phosphorylation de GSK3β et la translocation mitochondriale. Exp Mol Med (2023). https://doi.org/10.1038/s12276-023-01009-w

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Reçu : 15 août 2022

Révisé : 07 février 2023

Accepté : 15 mars 2023

Publié: 01 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s12276-023-01009-w

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