La cryoconservation des îlots pancréatiques par vitrification permet d'obtenir une viabilité, une fonction, une récupération et une évolutivité clinique élevées pour la transplantation

Nature Medicine volume 28, pages 798–808 (2022)Citer cet article

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La transplantation d'îlots pancréatiques peut guérir le diabète mais nécessite des îlots accessibles et de haute qualité en quantités suffisantes. La cryoconservation pourrait résoudre les problèmes de la chaîne d'approvisionnement des îlots en permettant des banques de qualité contrôlée et la mise en commun des îlots donneurs. Malheureusement, la cryoconservation n'a pas atteint cet objectif, car elle doit simultanément fournir une récupération, une viabilité, une fonction et une évolutivité élevées. Ici, nous atteignons cet objectif dans des îlots de cellules bêta dérivées de cellules souches (SC) de souris, de porcs, d'humains et d'humains (SC-bêta) par une optimisation complète de la composition de l'agent cryoprotecteur (CPA), des conditions de chargement et de déchargement du CPA et des méthodes de vitrification et réchauffement (VR). La viabilité des îlots post-VR, par rapport au contrôle, était de 90,5 % pour la souris, 92,1 % pour SC-bêta, 87,2 % pour le porc et 87,4 % pour les îlots humains, et elle est restée inchangée pendant au moins 9 mois de stockage cryogénique. Les îlots VR avaient une morphologie macroscopique, microscopique et ultrastructurale normale. Le potentiel de membrane mitochondriale et les niveaux d'adénosine triphosphate (ATP) ont été légèrement réduits, mais toutes les autres mesures de la respiration cellulaire, y compris le taux de consommation d'oxygène (OCR) pour produire de l'ATP, sont restées inchangées. Les îlots VR avaient une fonction normale de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS) in vitro et in vivo. Les îlots porcins et SC-bêta produisaient de l'insuline dans des modèles de xénotransplantation, et les îlots de souris testés dans un modèle de greffe syngénique de masse marginale ont guéri le diabète chez 92 % des receveurs dans les 24 à 48 h suivant la greffe. Un excellent contrôle glycémique a été constaté pendant 150 jours. Enfin, notre approche a traité 2 500 îlots avec > 95 % de récupération des îlots à > 89 % de viabilité post-dégel et peut facilement être mise à l'échelle pour un débit plus élevé. Ces résultats suggèrent que la cryoconservation peut désormais être utilisée pour fournir les îlots nécessaires à l'amélioration des résultats de transplantation qui guérissent le diabète.

Malgré 100 ans de développement thérapeutique depuis la découverte de l'insuline, les thérapies actuelles du diabète, telles que les glucomètres continus, les pompes à insuline et les systèmes en boucle fermée, restent un traitement de la maladie plutôt qu'un remède à la maladie1. Bien que les dernières décennies aient vu des progrès substantiels dans le développement de la greffe d'îlots comme traitement potentiel du diabète2, l'une des principales limites de cette approche est que les greffes d'un seul donneur sont souvent insuffisantes pour atteindre l'indépendance à l'insuline chez le receveur3,4. Fréquemment, deux, trois perfusions d'îlots de donneurs ou plus totalisant 700 000 à > 1 M d'équivalents d'îlots (IEQ) sont nécessaires pour un receveur « typique » de 70 kg5,6, ce qui ajoute des risques associés à des interventions chirurgicales répétées et à plusieurs cycles d'induction d'immunosuppression forte.

Une stratégie pour surmonter le problème d'approvisionnement en donneurs consiste à regrouper les îlots de plusieurs donneurs, en obtenant une dose élevée d'îlots avec une seule perfusion7,8, en augmentant l'efficacité et en réduisant les risques. Bien que plusieurs groupes aient montré la faisabilité de cultiver des îlots pendant de longues périodes (semaines à mois)9, la majorité ont signalé une récupération réduite des îlots et une perte de la fonction endocrinienne au fil du temps10,11. Ainsi, les grands essais cliniques limitent souvent la culture à 48–72 h avant la greffe12. Cette incapacité à cultiver ou à stocker des îlots de haute qualité pendant plus de quelques jours après l'isolement rend toutefois la mise en commun des îlots peu pratique sur le plan logistique. Une deuxième stratégie consiste à développer une source d'îlots alternative, telle que les îlots dérivés de SC, qui offrent la promesse passionnante d'un approvisionnement illimité en îlots13,14 et d'une moindre dépendance à la disponibilité limitée des donneurs. Les îlots dérivés de SC produisent de l'insuline en réponse au glucose, restaurent la normoglycémie dans certains modèles de transplantation animale et ont été testés dans des essais de phase 1 et 2 chez l'homme. Cependant, l'hétérogénéité de la composition des cellules endocrines et la variabilité de la fonction13 entraînent une variabilité considérable d'un lot à l'autre15, nécessitant une validation approfondie de chaque lot avant la transplantation, au cours de laquelle les îlots SC se détériorent en culture. L'incapacité de stocker les îlots avant utilisation est un défi commun aux deux stratégies. Un stockage à plus long terme est nécessaire pour surmonter les obstacles de la chaîne d'approvisionnement limitant la disponibilité de quantités suffisantes d'îlots et pour permettre une évaluation adéquate de la qualité avant la transplantation.

La cryoconservation, ou la stabilisation des biomatériaux à une température ultra basse (moins de -150 ° C), peut permettre la mise en commun, la mise en banque à long terme et la disponibilité immédiate de cellules et de tissus viables16,17. Les techniques conventionnelles de cryoconservation utilisent un refroidissement lent (c'est-à-dire < 1 °C min-1) des substances biologiques jusqu'à un état congelé déshydraté en présence de glace extracellulaire. L'ajout d'une faible concentration (~ 2 M) de CPA aide à stabiliser les cellules pendant la cryoconservation et améliore la viabilité cellulaire. Malgré une enquête approfondie (tableau supplémentaire 1 et les études examinées dans Kojayanet al.18), des défis persistent pour la cryoconservation des îlots en raison de blessures liées à la glace (c. c'est-à-dire, sérum bovin fœtal) nécessaire pour améliorer la viabilité.

Une alternative prometteuse aux méthodes de cryoconservation conventionnelles existantes est la vitrification sans glace ; c'est-à-dire le refroidissement rapide d'un biomatériau à un état vitreux19,20. Pour éviter la formation de glace, les taux de refroidissement et de réchauffement ultérieur doivent dépasser le taux de refroidissement critique (CCR) et le taux de réchauffement critique (CWR), respectivement. L'augmentation de la concentration de CPA (> 4 M) peut abaisser le CCR et le CWR requis à des niveaux atteignables, mais entraîner une toxicité dans les cellules et les tissus, en particulier à des températures plus élevées (> 4 ° C). Ainsi, il existe un point d'équilibre critique qui évite à la fois les blessures dues à la glace et à la toxicité du CPA tout en maintenant l'évolutivité clinique. Les stratégies précédentes de vitrification des îlots étaient limitées à de petits volumes avec de faibles quantités d'îlots (<150 îlots dans des volumes de microlitres de solution CPA; tableau supplémentaire 1) pour assurer des taux de refroidissement et de réchauffement suffisants, et l'augmentation volumétrique a réduit les taux de refroidissement et de réchauffement et a conduit à formation de glace, compromettant la viabilité. À notre connaissance, aucune technique publiée n'a simultanément atteint la cryoconservation des îlots avec une viabilité, une fonction et une récupération élevées dans un protocole cliniquement évolutif (tableau supplémentaire 1).

Pour atteindre cet objectif, nous avons mené des enquêtes systématiques sur le CPA (formulation, concentration, chargement et déchargement) et la méthode de vitrification (amélioration des taux de refroidissement et de réchauffement) pour développer une nouvelle méthode de cryoconservation des îlots qui permet simultanément une récupération, une viabilité, une fonctionnalité et une évolutivité élevées. Nous avons validé nos méthodes sur des îlots dérivés de SC de souris, porcins, humains et humains. Des évaluations in vitro approfondies de la viabilité, de la santé métabolique et de la sécrétion d'insuline ont été réalisées. Enfin, à l'aide de modèles de greffe syngéniques et xénogéniques, nous avons démontré qu'après la VR, les îlots restent viables in vivo, produisent de l'insuline, répondent au défi glycémique et guérissent le diabète. L'aperçu de notre technique est résumé dans la Fig. 1a.

a, La cryoconservation peut être la pierre angulaire d'une chaîne d'approvisionnement d'îlots, permettant la mise en commun, la mise en réserve et le contrôle de la qualité avant la transplantation. Les systèmes modèles utilisés pour explorer cela incluent les îlots de souris, porcins et humains et les îlots SC-bêta. Pour obtenir une récupération, une viabilité, une fonction et une évolutivité élevées simultanément, une optimisation systématique des paramètres interdépendants, y compris la toxicité du CPA, la formation de glace et les taux de refroidissement et de réchauffement pendant la cryoconservation VR, a été réalisée dans ces systèmes d'îlots. Les taux de refroidissement et de réchauffement obtenus peuvent ajuster l'équilibre entre la toxicité du CPA et la formation de glace. La morphologie, la viabilité, la santé métabolique et la fonction in vitro et in vivo des îlots ont été évaluées après cryoconservation VR. CSEh, cellule souche embryonnaire humaine. b, Schéma du cryomesh VR (pas à l'échelle). Après le chargement du CPA, les îlots en suspension ont été transférés dans le cryomesh et la solution de CPA en excès a été éliminée avant d'être plongée dans de l'azote liquide (LN2). c, profil de température mesuré représentatif de cryomesh VR. L'encart représente les taux de refroidissement et de réchauffement obtenus (n = 6, données présentées sous forme de moyenne ± sd avec des points de données individuels). d, la corrélation de la concentration de CWR et de CPA (équation (S2) dans les matériaux supplémentaires) indique qu'environ 44% en poids de CPA est minimalement nécessaire pour éviter la glace mortelle en utilisant cryomesh VR et montre où d'autres études n'ont pas réussi à utiliser un CPA avec un CWR adéquat pour éviter la glace dans leurs conditions de performances thermiques.

Pour cette étude, nous avons testé la fonction de cryoconservation et de post-réchauffement des îlots de souris, porcins, humains et SC-bêta. Les îlots SC-bêta étaient des grappes générées par différenciation d'une lignée SC embryonnaire humaine (HUES8) en six étapes à l'aide d'une programmation non génétique dans une culture en suspension 3D21. La Fig. 1 supplémentaire montre un exemple de caractérisation spécifique des cellules SC-bêta au cours de chaque étape de différenciation. Des îlots de souris et des îlots SC-bêta ont été utilisés pour le développement initial, et l'approche a ensuite été validée à l'aide d'îlots humains et porcins.

Nous avons d'abord examiné diverses approches de réalité virtuelle et évalué leurs performances en matière de refroidissement, de réchauffement et d'évolutivité. Nous avons comparé trois stratégies VR à base de gouttelettes couramment utilisées : (1) refroidissement par plat en cuivre et réchauffement par convection, (2) refroidissement par plat en cuivre et nanochauffage laser (des nanotiges d'or ont été ajoutées à la gouttelette pour générer de la chaleur lors de l'irradiation laser) et (3) convection refroidissement et réchauffement à l'aide d'un appareil cryotop (Fig. 2 supplémentaire; détails dans Méthodes). En bref, 10 à 20 îlots dans une goutte de 2 µl ont été vitrifiés puis réchauffés. Nous avons évalué les taux de refroidissement et de réchauffement par mesure directe ou par estimation via la modélisation (tableau supplémentaire 2)16. La viabilité après décongélation était de 56 %, 62 % et 55 % en utilisant les approches 1, 2 et 3, respectivement. Dans l'ensemble, chacune de ces approches a souffert d'une viabilité sous-optimale et de problèmes potentiels d'évolutivité (détails dans les résultats et la discussion supplémentaires).

Pour surmonter ces limitations basées sur les gouttelettes, nous avons ensuite testé un système cryomesh qui peut cryoconserver avec succès des embryons de Drosophila melanogaster22. Le cryomesh est constitué d'un filet de nylon (taille de pores de 38 µm) attaché à une poignée en plastique. Après avoir chargé le CPA dans les îlots en suspension, les îlots ont été transférés sur un support cryomesh et l'excès de solution de CPA a été éliminé par effet de mèche ; il s'agit d'une étape critique, car elle réduit l'encombrement de la masse thermique dans le système, laissant une fine couche d'îlots sur le cryomesh entouré d'un volume minimal de CPA (Fig. 1b). En éliminant cet excès de fluide, les taux de refroidissement et de réchauffement sont augmentés d'environ un ordre de grandeur à 5,4 × 104 et 30,9 × 104 °C min−1, respectivement, pendant le refroidissement/réchauffement convectif (Fig. 1c). L'élimination du CPA augmente également la densité des îlots dans le système par rapport à une gouttelette. Par exemple, une monocouche d'îlots étroitement tassée sur un maillage en nylon de 2 cm × 2 cm (c'est-à-dire 1,7 × 104 îlots) représente> 95% du volume sur le cryomesh, alors que 20 îlots dans une gouttelette de 2 µl n'occupent que 1,8% du volume total. Le tableau supplémentaire 2 résume les performances des approches cryomesh, gouttelettes et cryotop VR, en mettant l'accent à la fois sur les taux de refroidissement et de réchauffement améliorés et sur la capacité d'augmenter le cryomesh.

Après avoir établi les performances thermiques du système cryomesh, nous avons recherché une formulation CPA et un protocole de chargement/déchargement qui éviteraient la formation de glace tout en minimisant la toxicité. Grâce à une corrélation entre la concentration de CPA et CWR (équation (S2)), nous avons estimé que la concentration minimale de CPA à l'intérieur d'un îlot devrait être de 42 à 44 % en poids pour éviter la dévitrification (formation de glace) lors du réchauffement à 30,9 × 104 °C min−1 en utilisant le cryomesh (Fig. 1d). La toxicité du CPA peut survenir à la fois par des lésions chimiques et osmotiques. Pour éviter les blessures, nous avons testé l'ajout de CPA par étapes pour minimiser les dommages osmotiques (c'est-à-dire un rétrécissement de volume extrême inférieur à 60 % ou un gonflement de volume supérieur à 153 %) pendant le chargement et le déchargement, en évaluant également la toxicité chimique en fonction de la durée des étapes et d'une variété de formulations de CPA. .

Pour développer un protocole CPA de chargement et de déchargement optimisé, nous avons d'abord fabriqué un dispositif microfluidique pour mesurer les paramètres biophysiques des îlots, y compris le volume osmotique inactif (Vb), la perméabilité à l'eau de la membrane (Lp) et la perméabilité CPA (ω). Vb a été mesuré en enregistrant le volume d'équilibre final des îlots dans diverses concentrations de solution de NaCl hypertonique (Fig. 2b, panneau inférieur). Les courbes de Boyle – van't Hoff indiquent que le volume osmotiquement inactif pour les îlots de souris et SC-bêta était de 0, 5 et 0, 4, respectivement (Fig. 2c). Les paramètres de perméabilité membranaire (Lp, ω) ont été déterminés en enregistrant le comportement caractéristique de retrait-gonflement des îlots lors de l'exposition à des solutions CPA contenant 15% en poids de propylène glycol (PG), d'éthylène glycol (EG) et de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 4 ° C et 21 °C (Fig. 3 supplémentaire). Le «rétrécissement» se produit en raison de la perméabilité élevée à l'eau lors de l'exposition initiale au CPA, entraînant un écoulement d'eau des îlots. Ce rétrécissement est suivi d'une «houle» lorsque le CPA perméable se diffuse à travers la membrane cellulaire et que l'eau rentre lentement dans les îlots (Fig. 2b, panneau supérieur). Nous avons utilisé le modèle à deux paramètres basé sur Lp et Ps (= ωRT, R est la constante des gaz, T est la température absolue) pour ajuster les courbes de rétrécissement-gonflement expérimentales (détails dans les méthodes). Comme le montre la figure 2e, la perméabilité à l'eau (Lp) et au CPA (ω) ont des valeurs plus élevées à une température plus élevée pour les îlots de souris et de SC-bêta. Les différentes compositions cellulaires entre les îlots de souris et de SC-bêta ont probablement conduit à la différence de valeurs de perméabilité entre les deux types d'îlots. Bien que ce qui précède décrit le rétrécissement-gonflement lors du chargement, l'inverse se produit lors du déchargement, qui est un gonflement suivi d'un rétrécissement, comme indiqué ailleurs23.

a, Schéma du dispositif microfluidique utilisé pour mesurer les propriétés biophysiques des îlots (pas à l'échelle). Les changements morphologiques des îlots ont été enregistrés au microscope. PDMS, polydiméthylsiloxane. b, haut : lorsqu'il est soumis à 15 % en poids de DMSO à 4 °C, l'îlot se contracte d'abord, puis gonfle. Lors de l'exposition au CPA hypertonique, l'eau sort des cellules et l'îlot se rétrécit. Le CPA diffuse ensuite à travers les membranes cellulaires, suivi de la réentrée de l'eau dans la cellule, entraînant un gonflement vers son état initial. En bas : l'îlot est resté rétréci dans une solution de NaCl car les cellules sont imperméables au sel. Barres d'échelle, 100 µm. c, les tracés Boyle – van't Hoff des îlots de souris et de SC-bêta affichent le volume d'îlots normalisé (V/V0) en fonction du rapport d'osmolalité de la solution de NaCl isotonique et hypertonique (π0/π). Le volume osmotique inactif (Vb) qui ne participe pas à la réponse osmotique peut être estimé en extrapolant l'ajustement linéaire à π0/π = 0. Plus de détails peuvent être trouvés dans Méthodes (n = 4 pour les îlots SC-bêta, n = 8 pour les îlots de souris). d, Volume normalisé des îlots de souris et de SC-bêta en fonction du temps démontrant le comportement de rétrécissement-gonflement lorsqu'il est exposé à 15 % en poids de DMSO à 21 °C (n = 3 pour les îlots de souris, n = 9 pour les îlots de SC-bêta). e, Tableau récapitulatif de la perméabilité à l'eau (Lp) et au CPA (ω) des souris et des îlots SC-bêta à 4 ° C et 21 ° C (n = 3–9; la taille exacte de l'échantillon peut être trouvée dans la Fig. 3 supplémentaire). La couleur rouge représente l'îlot de souris dans les panneaux c, d, g, h et est utilisée dans le panneau e pour maintenir la cohérence avec le reste des panneaux. f, chargement par étapes (étapes 1 à 3) et déchargement (étapes 4 à 7) de 22 % en poids d'EG + 22 % en poids de DMSO pour les îlots. g, Modélisation du changement de volume normalisé des îlots pendant le chargement/déchargement du CPA à l'aide des propriétés biophysiques mesurées. Le volume des îlots de souris et de SC-bêta est resté dans la région sûre. h, concentration de CPA modélisée chez la souris et les îlots SC-bêta. Pour c–e, les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd

Avec ces paramètres (Vb, Lp et ω), la concentration intracellulaire en CPA, le volume des îlots et la toxicité chimique lors d'un chargement et d'un déchargement en plusieurs étapes ont été modélisés (équations (2) et (3) dans les méthodes, équation S1 dans les méthodes supplémentaires). Après optimisation, notre protocole de chargement CPA a utilisé les intervalles de pas de 10 minutes suivants : 21 °C à 1,3 M, 4 °C à 3,2 M et 4 °C à 6,5 M (Fig. 2f ; détails dans Résultats supplémentaires et discussion). Les excursions de volume des îlots de souris et de SC-bêta sont restées dans les tolérances osmotiques (Fig. 2g). Le modèle a prédit que la concentration de CPA serait de 6, 2 M à l'intérieur des îlots de souris et de 6 M pour les îlots SC-bêta (Fig. 2h).

Pour optimiser la formulation du CPA, nous avons testé trois concentrations globales de CPA (33 %, 44 % et 54 %) constituées de PG, d'EG, de DMSO ou de mélanges. Nous avons utilisé une coloration qualitative et quantitative vivante / morte pour mesurer la viabilité des îlots SC-bêta pour chaque CPA après chargement et déchargement (Fig. 2f) et à nouveau après VR. Les mesures qualitatives ont été déterminées par imagerie confocale d'îlots intacts après coloration à l'orange d'acridine (AO) et à l'iodure de propidium (PI) (Fig. 3a). Pour la mesure quantitative, les îlots traités au CPA avec ou sans VR ont été dissociés en cellules individuelles et colorés avec AO / PI, et le pourcentage de cellules vivantes (AO + / PI-) a été compté (Fig. 3b). La viabilité mesurée après le chargement et le déchargement reflète la toxicité du CPA. Une diminution supplémentaire de la viabilité après la VR reflétait vraisemblablement une blessure liée à la glace pendant le refroidissement et le réchauffement.

a, images au microscope confocal de témoins vivants et morts d'îlots SC-bêta colorés avec AO (cyan) et PI (rouge). b, images au microscope confocal (fusion AO/PI) d'îlots SC-bêta traités par CPA (chargement et déchargement CPA uniquement) et traités par VR (chargement CPA, déchargement VR et CPA). Diverses formulations de CPA ont été examinées. c, Viabilité cellulaire des îlots SC-bêta traités uniquement au CPA (cyan), traités au VR (vert) et témoins vivants (rouge). Les îlots ont été dissociés en cellules individuelles, et la viabilité a ensuite été mesurée. Le texte jaune dans b,c est utilisé pour mettre en évidence la condition optimale. Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec le test post hoc de Tukey a été utilisée pour comparer les groupes, et les valeurs P des comparaisons informatives par paires sont présentées (n = 4). d, e, Pour la viabilité des cellules d'îlots de souris ( d ) et SC-bêta ( e ) après différents temps de culture (0, 3 et 24 h) après traitement CPA uniquement, puis après traitement VR. Une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey a été utilisée pour comparer les groupes, et des comparaisons informatives par paires sont présentées (n = 4). Barres d'échelle, 100 µm. Les données sont présentées sous forme de points de données individuels et moyenne ± sd

Après le chargement et le déchargement du CPA, EG a démontré la moindre toxicité des îlots des trois composants individuels, suivi du DMSO et du PG (Fig. 3c). Lorsque des mélanges ont été utilisés à la même concentration totale (44 %), un mélange d'EG et de DMSO a fourni le moins de toxicité (la viabilité cellulaire était de 96,4 % du contrôle), surpassant l'EG ou le DMSO seul. La viabilité des îlots est également restée élevée (93, 3% du contrôle) après VR et est restée essentiellement inchangée sur 24 h de culture post-VR (Fig. 3d, e). La diminution de la concentration du mélange (à 34 %) a entraîné une baisse de la viabilité post-VR en raison de la formation de glace ; l'augmentation de la concentration (à 54%) a entraîné une viabilité inférieure en raison de la toxicité du CPA (Fig. 3c). La formulation CPA la mieux identifiée (22 % EG + 22 % DMSO) a été utilisée tout au long de l'étude.

À l'aide de la formulation CPA optimisée, des conditions de chargement et de déchargement et du système cryomesh de refroidissement/réchauffement, nous avons examiné la morphologie des îlots, la viabilité, la fragmentation de l'ADN (tache d'étiquetage dUTP nick end (TUNEL) médiée par TdT) et la translocation de l'annexine V après VR. Nous avons comparé VR à des îlots témoins vivants sains, témoins morts (traités à l'éthanol) et cryoconservés de manière conventionnelle (c'est-à-dire refroidissement lent dans 15% de DMSO) (Fig. 4). Après VR, chacun des quatre types d'îlots (souris, humain, porcin et SC-bêta) avait une apparence et une viabilité globales similaires aux îlots témoins frais et bien meilleures que les îlots cryoconservés de manière conventionnelle (Fig. 4a). Les îlots VR avaient des bordures lisses, une forme arrondie/oblongue et un aspect histologique normal impossible à distinguer des îlots frais, alors que de nombreux îlots cryopréservés de manière conventionnelle présentaient une perturbation de l'architecture macroscopique. Les différences étaient encore plus évidentes lors de l'examen ultrastructural par microscopie électronique à transmission (MET) (Fig. 4a, en bas). L'imagerie TEM a montré que les membranes cellulaires et nucléaires, les mitochondries, les granules de sécrétion et d'autres organites semblaient intacts dans les îlots VR. En revanche, les îlots cryoconservés de manière conventionnelle présentaient des changements qualitatifs bruts dans l'apparence des cellules, un nombre réduit de mitochondries et de granules de sécrétion et un saignement substantiel des membranes cellulaires et nucléaires.

a, La morphologie des îlots de souris de contrôle vivant, VR (cryoconservés par VR) et conventionnels (cryoconservés par congélation lente conventionnelle) a été évaluée par microscopie à fond clair, histologie hématoxyline et éosine (H&E) et TEM. Pour le groupe conventionnel, un mélange d'îlots intacts et rompus a été observé. Des exemples de morphologie brute d'îlots perturbés en raison de la formation de glace sont présentés dans l'histologie en fond clair et H&E. b, Viabilité (pourcentage du témoin vivant) des îlots de souris, SC-bêta, porcin et humain des groupes de traitement comprenant le témoin vivant, VR, VR 9 mois (îlots stockés dans LN2 pendant 9 mois avant réchauffement), conventionnels (cryopréservés par lent congélation) et témoin mort (traité par de l'éthanol à 75%). ND, pas fait. Une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Games-Howell a été utilisée pour comparer les groupes, et les valeurs P des comparaisons informatives par paires sont indiquées (n = 3–34 par groupe; nombre exact dans le tableau supplémentaire 3). c, images au microscope confocal (AO/PI) d'îlots de souris, SC-bêta, porcins et humains des groupes de traitement, y compris le contrôle vivant, VR et conventionnel. d, images colorées au TUNEL d'îlots de souris, de SC-bêta et d'humains des groupes de traitement, y compris le contrôle vivant, VR et conventionnel. Le panneau inférieur est la coloration à l'annexine V des îlots de souris des mêmes groupes de traitement. Les barres d'échelle représentent 2 µm pour TEM, 50 µm pour les images en fond clair, 70 µm pour l'histologie et les images TUNEL et 100 µm pour toutes les images de fluorescence. Les données sont présentées sous forme de points de données individuels et moyenne ± sd

Nous avons ensuite utilisé la coloration AO/PI pour mesurer les changements de viabilité associés à chaque technique de cryoconservation des îlots. Qualitativement, les îlots VR semblaient similaires aux îlots témoins vivants, avec seulement une légère augmentation du nombre de cellules rouges (nécrotiques ou mortes) (Fig. 4c et Fig. 5 supplémentaire) pour chacun des quatre types d'îlots. Les îlots cryopréservés de manière conventionnelle ont montré beaucoup plus de mort cellulaire. Après la cryoconservation, un ensemble séparé d'îlots a été dissocié en une suspension unicellulaire et testé pour la viabilité par cellule (Fig. 4b). La viabilité post-VR, par rapport au contrôle, était de 90,5 % pour la souris, 92,1 % pour le SC-bêta, 87,2 % pour le porc et 87,4 % pour l'homme. La viabilité est restée inchangée sur 9 mois de cryoconservation (88,3 % pour les îlots de souris et 91,8 % pour SC-bêta). La cryoconservation conventionnelle a entraîné une viabilité inférieure (59, 1 à 62, 2%) que les îlots VR.

Bien que nous ayons principalement examiné la viabilité globale des cellules des îlots, pour évaluer spécifiquement la viabilité des cellules exprimant l'insuline (bêta), nous avons cocoloré des îlots intacts ou dissociés avec des colorants vivants/morts fixables et des anticorps anti-insuline, puis évalué la viabilité des cellules bêta par microscopie confocale (analyse qualitative mesures, Fig. 6 supplémentaire) et FACS (mesures quantitatives, Fig. 7 supplémentaire) et ont constaté que les cellules positives et négatives à l'insuline semblaient avoir des viabilités similaires (détails dans Résultats supplémentaires et discussion).

En plus du faible degré de mort cellulaire observé (cellules PI +) avec les îlots VR, nous avons observé un peu plus de cellules TUNEL + et d'annexine V + de surface cellulaire après VR par rapport aux îlots témoins frais (Fig. 4d et Supplémentaire Fig. 8), suggérant la nécrose et l'apoptose peuvent contribuer à la diminution globale de 8 à 12 % de la viabilité avec la RV. Beaucoup plus de cellules TUNEL+ et Annexin V+ ont été observées avec des îlots cryoconservés de manière conventionnelle. Par rapport à la cryoconservation conventionnelle, notre technique VR a entraîné des améliorations substantielles dans la préservation de la viabilité et de la morphologie des types d'îlots testés.

Étant donné que la viabilité mesurée par les colorants de perméabilité membranaire représente un indicateur retardé du dysfonctionnement des îlots après le traitement, nous avons cherché à examiner d'autres mesures de la santé des îlots qui pourraient mieux définir la fonction attendue des îlots après la cryoconservation. Plus précisément, la santé métabolique, en particulier l'OCR des îlots, est prédictive de la fonction des îlots in vivo24,25. Nous avons d'abord examiné les niveaux d'ATP dans les îlots immédiatement après la VR et avons constaté qu'à ce moment-là, la teneur en ATP était nettement inférieure à celle des îlots témoins (Fig. 9 supplémentaire). Cependant, les niveaux d'ATP et d'autres mesures métaboliques (OCR et potentiel de membrane mitochondriale) ont été largement récupérés après 3 h de culture. Nous avons utilisé ce moment pour toutes les évaluations ultérieures.

Le potentiel de membrane mitochondriale dans chacun des quatre types d'îlots a été mesuré par coloration à l'ester éthylique de tétraméthylrhodamine (TMRE) et microscopie confocale qualitative et quantitative. L'intensité globale du signal était un peu plus faible pour les îlots VR que pour le contrôle vivant (65, 7 à 86, 3% du contrôle), mais une fois ajustée pour le contenu en cellules viables, l'intensité du TMRE était de 75, 1 à 93, 7% du contrôle (Fig. 5b, à gauche). La différence d'intensité de TMRE peut être due à une récupération plus lente au centre des îlots où il y avait une certaine clarté centrale. Cet aspect a semblé s'améliorer encore avec 24 h de culture (Fig. 9 supplémentaire). L'intensité de la coloration TMRE pour les îlots cryoconservés de manière conventionnelle était de 37 à 42% des îlots témoins (Fig. 5b).

a, Potentiel de membrane mitochondriale (via la coloration TMRE) des îlots de souris, SC-bêta, porcins et humains des groupes de traitement, y compris le contrôle vivant, VR et conventionnel. b, Gauche : Quantification de l'intensité de la coloration TMRE. Les comparaisons entre les groupes de contrôle vivant et de traitement ont été effectuées par les tests de Kruskal-Wallis et de Wilcoxon par paires (n = 3-16 par groupe). Droite : Mesure des niveaux d'ATP de quatre types d'îlots de groupes témoins vivants et morts et de groupes de cryoconservation (VR et conventionnels). Une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Games-Howell a été utilisée pour comparer les groupes, et les valeurs P des comparaisons informatives par paires sont indiquées (n = 3–12/groupe). c, Exemple de courbe OCR montrant le changement d'OCR pendant le test de stress Mito dans les îlots SC-bêta et comparant le contrôle vivant, la VR, la cryoconservation conventionnelle et les îlots témoins morts (n = 5 à 8 par groupe à chaque instant). d, Compilation des paramètres OCR métaboliques pour chaque type d'îlot et chaque groupe de traitement. Une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey a été utilisée pour comparer les groupes, et des différences significatives (P < 0,05) par paires sont affichées (n = 3–33 par groupe). e, Test GSIS in vitro pour les îlots de souris, SC-bêta et humains des groupes de traitement, y compris le contrôle vivant, VR et conventionnel. Une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey a été utilisée pour comparer les groupes, et des comparaisons informatives par paires sont présentées (n = 3–12/groupe). En b, d et e, les valeurs P de comparaison statistique pertinentes sont incluses dans les tracés. Barres d'échelle, 100 µm. Les données sont présentées sous forme de points de données individuels et moyenne ± sd Pour b–e, le nombre exact de répétitions peut être trouvé dans le tableau supplémentaire 3. RLU, unités lumineuses relatives.

Le nombre et l'apparence des mitochondries observées par TEM des îlots VR étaient qualitativement similaires à celles des cellules d'îlots témoins (Fig. 4a, en bas). Semblables aux résultats du TMRE, les niveaux globaux d'ATP dans les îlots VR étaient légèrement inférieurs à ceux des îlots témoins frais (Fig. 5b, à droite). Ces données suggèrent que la machinerie cellulaire pour produire de l'ATP est restée intacte, mais les niveaux d'ATP n'avaient pas encore été entièrement restaurés pour contrôler les valeurs au moment du dosage.

Après avoir montré des mitochondries intactes, nous avons ensuite examiné la respiration cellulaire pour déterminer si les îlots VR consommaient de l'oxygène pour restaurer l'ATP. Par rapport aux îlots témoins frais, les îlots VR ont montré un schéma similaire de changements dans l'OCR suite à une stimulation avec de l'oligomycine (ATP synthase / inhibiteur du complexe V), du cyanure de carbonyle 4-trifluorométhéoxyphénylhydrazone (FCCP) (agent de découplage de la membrane mitochondriale), et un mélange de roténone (inhibiteur du complexe I) et antimycine A (inhibiteur du complexe III) (Fig. 5c). Les îlots cryopréservés de manière conventionnelle ont montré une réponse au stress OCR atténuée. Lors de la comparaison de la VR à un contrôle frais chez la souris, l'homme et les îlots SC-bêta, il n'y avait aucune différence dans l'OCR pour la respiration basale, la production d'ATP, la fuite de protons, la respiration maximale, la capacité respiratoire disponible et la respiration non mitochondriale (Fig. 5d). Ces données suggèrent que les îlots VR maintiennent une fonction métabolique normale telle que mesurée par la respiration cellulaire.

Nous avons effectué des tests GSIS pour déterminer si les îlots étaient fonctionnels in vitro. La souris, le SC-bêta et les îlots humains ont sécrété de l'insuline en réponse à une provocation au glucose et, pour la souris et le SC-bêta, en outre avec une dépolarisation complète à l'aide de KCl (Fig. 5e). Les îlots porcins n'ont pas été testés. Les îlots humains avaient une libération maximale d'insuline avec une provocation à haute teneur en glucose, mais aucune autre libération avec du KCl. Les indices de stimulation (rapport de l'insuline libérée avec l'exposition à une concentration élevée en glucose à celle d'un glucose faible) pour les îlots VR de chaque type d'îlot mesuré n'étaient pas différents des îlots témoins. Les îlots cryoconservés de manière conventionnelle ont également montré une libération d'insuline en réponse à une provocation au glucose, mais à un degré moindre. Ces données confirment que les îlots VR sont viables, métaboliquement actifs et fonctionnels in vitro.

Comme mesure finale de la fonction des îlots post-VR, nous avons testé des îlots de souris, de porc et de SC-bêta dans des modèles de greffe de souris syngéniques et xénogéniques (Fig. 6). Les îlots de souris syngéniques transplantés sous la capsule rénale ont démontré une fonction et restauré la normoglycémie dans les 48 h (Fig. 6a) et ont montré une intense coloration par immunofluorescence de l'insuline similaire aux îlots témoins au jour 60 après la greffe, tout comme les xénogreffes porcines et SC-bêta chez les diabétiques non obèses immunodéficients. -Il2rgc−/− (NSG) receveurs (Fig. 6b). Les îlots de souris et de porc présentaient également une coloration intense du glucagon, bien que potentiellement avec une légère réduction qualitative de l'intensité du signal par rapport aux îlots témoins. Comme prévu, les greffes de SC-bêta ont montré une faible coloration au glucagon, car elles avaient été différenciées en une lignée de cellules bêta21,26. Les îlots cryoconservés de manière conventionnelle avaient une très faible intensité de coloration à l'insuline ou au glucagon.

a, Taux de glycémie de souris diabétiques induites par la streptozotocine après transplantation syngénique d'îlots de souris de masse marginale (250 îlots par receveur) des groupes de traitement, y compris le contrôle vivant, VR, VR avec stockage cryoconservé de 9 mois (îlots stockés dans LN2 pendant 9 mois ) et cryoconservation classique (450 îlots par receveur). Toutes les comparaisons par paires avec une valeur P <0,05 sont présentées (*P <0,05), comme déterminé par ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc Games–Howell [(n = 10 (témoin et cryoconservation conventionnelle), 9 (VR), 1 ( Fonction partielle VR) et 3 (9 mois de stockage et VR)). b, coloration à l'insuline (rouge) et au glucagon (vert) dans des modèles de greffe de souris syngéniques (souris) et xénogéniques (porcins et SC-bêta). Les groupes de traitement des îlots comprennent le contrôle vivant, VR et conventionnel. La coloration au 4′,6-Diamidino-2-phénylindole (bleu) est montrée dans les images fusionnées. c, IPGTT de souris de type sauvage (WT), de souris diabétiques et de souris diabétiques transplantées avec un contrôle vivant, VR et des îlots cryoconservés conventionnels (à gauche). Aire sous la courbe (AUC) de l'IPGTT (panneau de droite). Les groupes ont été comparés par ANOVA unidirectionnelle et test post hoc de Tukey, et seules des comparaisons informatives par paires sont présentées (n = 9–10 par groupe). d, Xénotransplantation d'îlots SC-bêta chez des souris NSG avec des taux plasmatiques d'insuline humaine non à jeun à 4, 8 et 12 semaines après la transplantation. e, À 14 semaines, niveau d'insuline plasmatique des souris NSG après le jeûne et 30 min après la stimulation de la production d'insuline par injection intrapéritonéale de glucose. Pour d et e, la comparaison de groupe se fait par ANOVA unidirectionnelle et test post hoc de Tukey avec des comparaisons informatives présentées (n = 3–5/groupe de traitement). Barres d'échelle, 200 µm. Les données sont présentées sous forme de points de données individuels et moyennes ± sd Pour c – e, le nombre exact de répétitions peut être trouvé dans le tableau supplémentaire 3.

À l'aide d'un modèle de greffe xénogénique, nous avons ensuite testé la fonction des îlots SC-bêta in vivo. Des îlots SC-bêta ont été transplantés chez des souris NSG non diabétiques et des échantillons de sérum aléatoires ont été obtenus pour mesurer l'insuline humaine à 4, 8 et 12 semaines après la transplantation (Fig. 6d). Les îlots VR ont sécrété de l'insuline humaine tout au long des 12 semaines. Les îlots SC-bêta conventionnellement cryopréservés avaient une production d'insuline humaine détectable, mais ces niveaux n'étaient pas statistiquement différents de ceux des faux receveurs de greffe. À 14 semaines, les souris receveuses ont été testées pour le jeûne et la production d'insuline humaine stimulée par injection intrapéritonéale de glucose (Fig. 6e). Les receveurs de greffe d'îlots cryoconservés de manière conventionnelle avaient de l'insuline humaine détectable, mais il n'y avait pas d'augmentation des niveaux après la stimulation. Les receveurs d'îlots VR avaient des niveaux de jeûne plus élevés que les îlots simulés ou cryoconservés de manière conventionnelle et ont démontré une augmentation de 2,3 fois après stimulation, confirmant la fonction SC-bêta in vivo.

Le contrôle frais, la réalité virtuelle et les îlots de souris cryoconservés de manière conventionnelle ont ensuite été testés dans un modèle de greffe d'îlots syngéniques de masse marginale (250 îlots par receveur) en utilisant des receveurs diabétiques induits par la streptozotocine. Dans l'ensemble, les îlots VR ont rapidement rétabli la normoglycémie chez 92 % (11/12) des receveurs dans les 24 à 48 h (Fig. 6a). Dans l'évaluation bivariée de Kaplan Meier, le temps jusqu'à la normoglycémie n'était pas différent des receveurs vivants d'une greffe d'îlots témoins (test du log-rank, P = 0,063). Un receveur d'îlots VR n'a démontré qu'une fonction partielle, potentiellement due à des problèmes techniques (c'est-à-dire une fuite d'îlots de la capsule rénale). La glycémie de ce receveur est tombée en dessous de 200 mg dl-1 le 13e jour après la greffe, puis a présenté une hyperglycémie modérée continue.

En revanche, les îlots cryoconservés de manière conventionnelle n'ont pas réussi à normaliser la glycémie (BG) chez tous les receveurs, même avec un nombre accru d'îlots (450 îlots par receveur). Un sous-ensemble de greffes a subi une néphrectomie unilatérale du rein greffé d'îlots (Fig. 10 supplémentaire). L'hyperglycémie s'est développée rapidement chez toutes les souris, confirmant que les îlots transplantés, et non les îlots receveurs natifs, contrôlaient les niveaux de glycémie.

Dans les greffes syngéniques, le contrôle glycémique était extrêmement serré pour les îlots VR. Les taux aléatoires de glycémie n'étaient pas plus élevés que ceux des greffes d'îlots témoins tout au long de l'évolution post-transplantation (jusqu'à 150 jours post-transplantation). Pour tester le résultat du temps de cryoconservation prolongé, nous avons vitrifié des îlots, les avons stockés dans du LN2 pendant 9 mois puis les avons réchauffés. Ces greffes d'îlots stockés à long terme ont également démontré une normalisation rapide de la glycémie et une stabilité du glucose tout au long de la période de suivi.

Pour démontrer le niveau de contrôle glycémique, nous avons effectué un test de tolérance intrapéritonéale au glucose (IPGTT) au jour 50 après la greffe (Fig. 6c). Il n'y avait aucune différence dans les courbes de réponse au glucose (Fig. 6c, à gauche) ou les aires sous les courbes (Fig. 6c, à droite) pour les souris de type sauvage non traitées, les greffes d'îlots témoins frais et les greffes de VR. Les receveurs d'îlots cryoconservés de manière conventionnelle avaient une réponse glycémique similaire à celle des souris témoins diabétiques.

La récupération des îlots de notre processus VR à l'échelle standard (400 à 2 000 îlots par test) était de 96,8 ± 1,3 % pour la souris (n = 26), 96,6 ± 1,7 % pour le SC-bêta (n = 26), 91,3 ± 3,4 % pour le porc ( n = 3) et 96,7 ± 1,5% pour les îlots humains (n ​​= 6) (Fig. 11 supplémentaire). Lorsque nous sommes passés à un débit moyen (2 500 îlots par test), la récupération des îlots de souris était de 95,9 ± 1,2 % (viabilité de 89,4 %, n = 3) et la récupération des îlots SC-bêta était de 98,2 ± 1,1 % (n = 4 ). Enfin, dans notre premier test de preuve de concept de VR d'îlots SC-bêta à haut débit (10 000 îlots par test), la récupération était de 92,6 % (n = 1).

Étant donné que le système cryomesh pour VR est intrinsèquement unidimensionnel, la mise à l'échelle dans les dimensions x et y n'est théoriquement limitée que par la géométrie du conteneur. Pour ces expériences, les îlots ont été vitrifiés sur un maillage de 2 cm × 2 cm jusqu'à 4 250 îlots par cm2. Pour atteindre un débit cliniquement significatif, des unités de 100 000 îlots pourraient ainsi être conservées sur des cryomailles de 24 cm2.

La transplantation d'un nombre suffisant d'îlots pancréatiques de haute qualité, viables et fonctionnels chez un patient diabétique peut guérir cette maladie de plus en plus courante et progressivement débilitante. Une limitation majeure affectant le succès de la transplantation d'îlots est le manque d'un approvisionnement à la demande d'un nombre suffisant d'îlots natifs ou dérivés de SC de haute qualité, une limitation qui est exacerbée par l'incapacité de stocker ces produits cellulaires avant utilisation. Ici, nous montrons, pour la première fois, une méthode efficace pour la préservation à long terme des îlots qui atteint simultanément une viabilité, une récupération, une fonction et une évolutivité élevées. Une telle méthode de banque d'îlots pancréatiques via la cryoconservation pourrait révolutionner la chaîne d'approvisionnement pour l'isolement, l'allocation et le stockage des îlots avant la greffe, augmentant l'utilisation globale des pancréas de donneurs décédés et guérissant davantage de patients diabétiques.

Des études antérieures ont exploré à la fois les méthodes conventionnelles (refroidissement lent) et la vitrification (refroidissement rapide) pour la cryoconservation des îlots, obtenant divers degrés de succès (tableau supplémentaire 1). Par exemple, Rajotte et al.27,28 et d'autres groupes29,30 ont démontré la cryoconservation conventionnelle des îlots à l'aide d'un CPA standard (2 M DMSO), mais n'ont atteint qu'une viabilité et une fonction faibles à modérées et à un débit limité (10 à 100 îlots). Les améliorations apportées au protocole (c'est-à-dire différents CPA) ont entraîné une meilleure fonction31,32 ou un meilleur débit (≥10 000 îlots)33,34, mais pas les deux simultanément. La cryoconservation conventionnelle a été testée dans des essais cliniques limités35 mais n'a jamais été pleinement adoptée en partie en raison de l'utilisation de sérum bovin fœtal, qui comporte un risque d'infection zoonotique. Pendant ce temps, plusieurs groupes ont testé la vitrification (c'est-à-dire la cryoconservation sans glace) comme alternative favorable pour améliorer la viabilité et la fonction23,36,37,38,39. Les études initiales ont démontré une preuve de principe, mais avec un faible débit d'îlots (50 à 300 îlots) et une fonction partielle23,40. En modifiant la géométrie du système grâce à l'utilisation de gouttelettes41, de fibres creuses39 ou de supports maillés37,38, d'autres groupes ont amélioré les vitesses de refroidissement et de chauffage et obtenu de modestes améliorations de fonctionnement, mais au prix d'un débit inférieur (souvent seulement 25 à 100 îlots à la fois ).

En plus de son efficacité dans la cryopréservation d'îlots pancréatiques de souris, porcins et humains fraîchement isolés, l'approche VR était également efficace pour les îlots humains dérivés de SC. Les îlots SC-bêta constituent une source prometteuse de cellules humaines pour le remplacement des cellules bêta, démontrant une sécrétion d'insuline sensible au glucose in vitro et un contrôle glycémique à long terme dans des modèles de souris diabétiques21,42. Des efforts considérables sont en cours pour améliorer la technologie des cellules bêta dérivées de SC afin d'obtenir une fonction physiologique robuste ; créer des méthodes de différenciation efficaces et peu coûteuses ; et améliorer le complément des cellules endocrines (c'est-à-dire produire avec un mélange de cellules alpha et bêta)43,44. Néanmoins, un approvisionnement solide en îlots SC-bêta de haute qualité, tels que ceux permis par la cryoconservation, est toujours nécessaire pour réaliser une disponibilité prête à l'emploi pour une future adoption clinique. Notre méthode de cryoconservation fournit une solution potentielle, démontrant une viabilité élevée (92,1 %) et une fonctionnalité in vitro et in vivo des îlots SC-bêta, même après 9 mois de stockage dans LN2. Le stockage à long terme permettrait la manipulation immunitaire des receveurs potentiels, permettrait un contrôle complet de la qualité des îlots avant la transplantation et augmenterait la rentabilité en permettant la cryoconservation de grands lots dans des unités fonctionnelles à patient unique. Ces résultats suggèrent que notre nouveau protocole de cryoconservation peut être un moyen puissant d'améliorer la chaîne d'approvisionnement des îlots SC-bêta, augmentant ainsi les options thérapeutiques pour les patients diabétiques.

Pour les îlots SC-bêta et les îlots donneurs décédés, l'évolutivité de la méthode de cryoconservation est essentielle. Une mise à l'échelle supplémentaire de notre approche pour un débit clinique significatif (c'est-à-dire ≥ 100 000 îlots) peut être obtenue en utilisant des tailles de cryomesh plus grandes et des facteurs de forme alternatifs tels que l'empilement de mailles (Fig. 12 supplémentaire). Pour une taille de maille cryogénique plus grande, lorsque la maille est plongée rapidement et uniformément, les flux de refroidissement et de réchauffement et la masse thermique (par unité de surface) resteront indépendants de la taille et de la forme de la maille, à condition que les bains de refroidissement/réchauffement soient dimensionnés de manière adéquate (c'est-à-dire , plus grand que le cryomesh) et le bain de réchauffement est agité. En outre, la solution restante de CPA (entraînée en raison de la tension superficielle) entre les îlots et le cryomesh «colle» temporairement les îlots au cryomesh, et les îlots ne se détachent pas du cryomesh pendant le stockage dans LN2.

Nos résultats jettent les bases de la future cryoconservation des îlots cliniques et suggèrent qu'une viabilité, une fonctionnalité (in vitro et in vivo) et une évolutivité élevées peuvent être obtenues simultanément pendant la cryoconservation des îlots de souris, de porc, d'humain et de SC-bêta. Des efforts supplémentaires sont nécessaires pour remédier aux limites de notre approche, y compris l'optimisation CPA pour les îlots humains ; une caractérisation plus poussée des réponses au stress, à l'adaptation et aux blessures des îlots ; mise à l'échelle jusqu'à un débit de> 300 000 îlots par lot (les rendements typiques pour l'isolement d'un seul donneur sont <300 000 IEQs5); et adaptation au traitement de qualité clinique (détails dans Résultats supplémentaires et discussion). Nous pensons que chacune de ces limitations sera facilement surmontée dans les développements futurs.

Les implications d'une méthode réussie pour la cryoconservation des îlots avant la transplantation sont profondes. Une telle technologie présente les avantages suivants : (1) une efficacité améliorée grâce à des greffes d'îlots de donneurs regroupés à haute dose ; (2) une meilleure opportunité pour le contrôle et l'évaluation de la qualité ; (3) une meilleure préparation du patient en transformant une opération non planifiée en un événement planifié ; (4) diminution du risque en utilisant une seule perfusion d'îlot plutôt que des perfusions répétées ; (5) une meilleure possibilité d'appariement HLA du donneur et du receveur en sélectionnant dans une banque d'options disponibles plutôt qu'en utilisant le prochain donneur en ligne ; (6) des protocoles d'induction de tolérance facilités qui nécessitent un préconditionnement du receveur avant les greffes, comme la tolérance obtenue par la perfusion de leucocytes apoptotiques du donneur45 ou le chimérisme mixte avec des îlots et une greffe de SC hématopoïétique dérivée du donneur ; et (7) une meilleure utilisation des organes en favorisant l'isolement des îlots et la mise en banque de tous les donneurs appropriés plutôt que des seuls donneurs «optimaux» qui ont été historiquement sélectionnés pour maximiser les rendements dans l'espoir de greffes à donneur unique.

Les comités institutionnels de soins et d'utilisation des animaux de l'Université du Minnesota (protocole 1905-37028A) et de la clinique Mayo (protocole A00003973) ont approuvé les études sur les animaux. Les souris ont été hébergées avec un cycle d'éclairage de 14 h allumé/10 h éteint, une température ambiante de 68 à 74 °F et une humidité de 30 à 70 % dans des installations spécifiques exemptes d'agents pathogènes (pour les souris NSG) ou conventionnelles (pour les souris C57BL/6). .

Des îlots de souris ont été isolés à partir de femelles reproductrices retraitées C57BL / 6 (âge non spécifié, Charles River Laboratories) par digestion à la collagénase (CIzyme RI, VitaCyte) et enrichissement en gradient de densité Histopaque (Millipore Sigma)46. Les îlots ont ensuite été triés sur le volet et cultivés dans un bioréacteur (réacteur ABLE Biott, BWV-S03A) dans du milieu S3 pendant 16 h avant utilisation. Les îlots humains ont été achetés auprès d'un fournisseur commercial (Prodo Laboratories) et cultivés dans du milieu complet PIM (S) (Prodo Laboratories) jusqu'à 7 jours avant utilisation. Des îlots porcins ont été isolés à partir de porcs Landrace adultes47.

Les cellules HUES8 ont été cultivées sous forme de sphéroïdes dans des flacons spinner de 500 ml (Corning, 3153)21. Des cultures en suspension ont été établies en ensemençant 150 millions de cellules (5 × 105 cellules ml-1) dans du milieu mTeSR1 (STEMCELL Technologies, 85850) avec 10 µM de Y27632 (R&D Systems, 1254) et maintenues à 70 tr/min à l'intérieur de l'incubateur humidifié à 37 °C , 5 % de CO2 et 100 % d'humidité. Le support a été changé à 48 h pour mTeSR1 sans Y27632. Les cellules ont été passées toutes les 72 h en les dispersant dans des cellules individuelles à l'aide d'Accutase (Millipore Sigma, A6964) avec perturbation mécanique et remises en suspension dans du mTeSR1 frais avec Y27632.

Les différenciations SC-bêta ont été initiées après 3 jours de formation et d'expansion de sphéroïdes SC dans un milieu mTeSR1 à l'intérieur d'un flacon rotatif21,26. Les grappes ont été autorisées à se déposer par gravité et les milieux ont été remplacés par des milieux spécifiques au protocole, y compris des facteurs de croissance appropriés. La différenciation cellulaire a été dirigée séquentiellement vers l'endoderme définitif, le tube intestinal primitif, le progéniteur pancréatique 1, le progéniteur pancréatique 2, les progéniteurs endocriniens et enfin dans SC-beta26. Les types de supports basaux (S1, S2, S3 et BE5) ont été complétés par des signaux inductifs (détails dans les méthodes supplémentaires). Les îlots SC-bêta ont été caractérisés par cytométrie en flux (détails dans les méthodes supplémentaires).

Les dispositifs microfluidiques utilisés pour mesurer les paramètres biophysiques des îlots ont été fabriqués à l'aide de procédures de lithographie douce (détails dans les méthodes supplémentaires). Des îlots triés sur le volet ont été introduits dans le dispositif de manière rétrograde à travers le trou de sortie. Après avoir lancé un flux antérograde à l'aide d'un milieu d'îlots, une solution de CPA/sel de la concentration souhaitée a été chargée via une pompe à seringue. Pour les CPA, 15% en poids d'EG, de PG et de DMSO préparés dans du RPMI ont été utilisés. Pour les solutions salines, du chlorure de sodium à 1,8 %, 2,7 %, 3,6 % et 4,5 % préparé dans de l'eau déminéralisée a été utilisé. Une fois l'îlot posé sur le fond du canal, le débit de solution CPA/sel a été progressivement augmenté tout en minimisant le mouvement et la rotation de l'îlot. Le flux de solution a été arrêté après qu'au moins cinq volumes de dispositif de solution aient été pompés à travers le dispositif. Pour les expériences réalisées à 4 °C, l'intégralité de l'expérience a été réalisée dans une chambre froide maintenue à la même température. Les changements de section transversale des îlots ont été enregistrés et analysés à l'aide de MATLAB pour estimer les changements de volume sphérique des îlots.

Un modèle à deux paramètres utilisant Lp (conductivité hydraulique, également appelée perméabilité à l'eau) et ω (perméabilité CPA) a été appliqué pour ajuster les données expérimentales de retrait-gonflement48. Les hypothèses sont détaillées dans les documents supplémentaires. Le volume de cellules osmotiques inactives, Vb, a été déterminé à partir de la relation Boyle-van't Hoff49. L' équation de Boyle – van't Hoff corrèle le volume d'équilibre cellulaire avec l'osmolalité de la solution non perméable comme ci-dessous:

où V est le volume d'équilibre cellulaire, V0 est le volume cellulaire isotonique, Vb est la fraction volumique osmotiquement inactive de la cellule, π0 est l'osmolalité isotonique et π est l'osmolalité de la solution non perméable.

MATLAB a été utilisé pour ajuster les Lp et ω des îlots de souris et de SC-bêta à partir des courbes expérimentales de rétrécissement-gonflement. La modélisation du changement de volume des îlots et de la CPA intracellulaire est basée sur le modèle « non couplé » à deux paramètres suggéré par Kleinhans48, comme suit :

où V et A sont respectivement le volume et la surface de l'îlot ; nC est le nombre de moles de CPA à l'intérieur de l'îlot ; R est la constante des gaz ; T est la température absolue ; Lp et ω sont respectivement la conductivité hydraulique et la perméabilité de la membrane au CPA ; et C est la molalité. Les exposants i et e désignent respectivement intracellulaire et extracellulaire. Les indices C et S désignent respectivement le CPA pénétrant et les solutés non pénétrants.

Les îlots ont été cryopréservés via une approche de congélation lente légèrement modifiée basée sur le protocole précédemment établi par Rajotte et al.50. Aucun sérum bovin fœtal ou sérum de veau fœtal n'a été inclus dans la solution de CPA. À 21 ° C, du DMSO a été ajouté à la suspension d'îlots pour atteindre une concentration finale de 2 M dans un cryotube. Après une incubation de 25 minutes avec du DMSO, le cryotube a été placé dans un bain d'éthanol à -7,5 ° C pendant 5 minutes. Une tige métallique a été refroidie dans du LN2 et utilisée pour ensemencer de la glace en touchant la suspension dans le cryotube. Après 15 min de libération de chaleur latente de fusion, le cryotube a été refroidi à 0,25 ° C min-1 à -40 ° C à l'aide d'un congélateur à vitesse contrôlée (Kryo 560, Planer Limited) puis plongé dans LN2. La décongélation a été réalisée à l'aide d'un bain-marie à 37 °C. Les îlots décongelés ont été placés dans du saccharose 0,75 M pendant 30 min à 0 ° C pour éliminer le CPA intracellulaire.

Le CPA à pleine puissance utilisé était de 22% en poids d'EG + 22% en poids de DMSO préparé dans un milieu RPMI. Pour charger le CPA, les îlots ont d'abord été incubés dans 20 % de CPA (c'est-à-dire 4,4 % en poids d'EG + 4,4 % en poids de DMSO) pendant 10 min à 21 °C, suivis de 50 % de CPA pendant 10 min à 4 °C et à 100 % CPA pendant 10 min à 4 ° C. La suspension d'îlots a ensuite été transférée sur le cryomesh placé sur un matériau à effet de mèche (c'est-à-dire une serviette en papier). La solution CPA a été évacuée à travers le filet de nylon et les îlots sont restés sur le cryomesh. L'agglutination des îlots a été évitée. Le cryomesh a été rapidement plongé dans LN2 et stocké dans un réservoir LN2. Pour décongeler les îlots, le cryomesh a été plongé rapidement dans la solution de réchauffement composée de 11 % en poids d'EG, 11 % en poids de DMSO et 5 % en poids de saccharose à 4 °C pour l'élimination du CPA. Après 10 min, la solution de réchauffement a été diluée deux fois en utilisant une solution glacée de saccharose à 10 % en poids, et les îlots ont été incubés pendant 10 min supplémentaires à 4 °C. Les îlots ont ensuite été transférés à 21 ° C et la suspension a été diluée deux fois en utilisant une solution de saccharose à 10 % en poids. Après 5 min, les îlots ont été replacés dans du milieu RPMI pendant 15 min comme dernière étape d'élimination du CPA. A ce moment, tous les îlots se détachent du filet de nylon.

En utilisant la même procédure de chargement CPA que dans l'approche cryomesh VR, 10 à 20 îlots ont été inclus dans une gouttelette de 2 µl et placés sur le cryotop. Le cryotop a été rapidement plongé dans LN2 pour la vitrification. Le processus de réchauffement et d'élimination du CPA était le même que celui effectué dans le cryomesh VR.

Une gouttelette de 2 µl, comprenant 10 à 20 îlots, a été déposée sur une boîte en cuivre flottant dans du LN2 pour la vitrification. La gouttelette vitrifiée a été réchauffée par convection dans la solution de déchargement. Les étapes d'élimination du CPA ont été conservées comme dans l'approche cryomesh VR.

Des nanobâtonnets d'or (nanoComposix) ont été ajoutés à la gouttelette pour atteindre la concentration de 2,8 × 1010 parties ml-1. Après vitrification de l'îlot et de la gouttelette incrustée de nanotiges d'or (2 µl) sur la plaque de cuivre prérefroidie, un laser à impulsions de 1064 nm a été utilisé pour réchauffer la gouttelette17. La durée d'impulsion était de 7,5 ms et la tension du laser était de 250 V. Une caméra haute vitesse (Nac Image Technology, Q1v) a été utilisée pour enregistrer le processus de réchauffement du laser à 4 000 images par seconde.

Les ultrastructures des îlots ont été analysées par MET. En bref, les îlots ont été fixés dans du glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,4) à 4 °C pendant une nuit et post-fixés dans du tétroxyde d'osmium aqueux à 2 % pendant 1 h, déshydratés progressivement dans de l'éthanol (30 % à 100 %) et de l'oxyde de propylène. , inclus dans Epon812 et durci pendant 48 h à 60 ° C. Ensuite, des sections ultrafines de 65 nm ont été collectées sur des grilles de cuivre de 200 mesh et colorées avec de l'acétate d'uranyle (15 min) et du citrate de plomb (2 min) avant examen par TEM. Les images ont été capturées avec un microscope électronique à transmission FEI Tecnai G2 Spirit (Thermo Fisher Scientific).

La mesure qualitative de la viabilité des îlots intacts a été réalisée en utilisant AO et PI. Les îlots intacts ont été colorés avec 8 ng ml-1 AO et 20 ng ml-1 PI (Millipore Sigma) pendant 2 min à température ambiante, couverts et imagés à l'aide d'un microscope confocal inversé Olympus Fluoview 3000 (Olympus) avec des filtres 502/525 nm pour AO et filtres 493/636 nm pour PI. Les images ont été capturées à une résolution de 4 020 × 4 020 pixels à l'aide d'un objectif de grossissement 20 ×. Notez que les diamètres des îlots dans toutes les images confocales, ici et tout au long de l'étude, sont augmentés en raison de la compression de la lamelle utilisée pour augmenter la profondeur d'imagerie efficace.

La viabilité quantitative a été mesurée sur des cellules d'îlots dissociés. Après le traitement des îlots, les îlots ont été incubés dans un flacon de culture dynamique à 70 tr/min, 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 3 h dans du milieu S3. Les îlots ont été dissociés en suspensions unicellulaires dans TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific, 12605010), trempés avec du S3 contenant du sérum bovin fœtal et colorés avec 8 ng ml-1 AO plus 20 ng ml-1 PI. Après 15 s d'incubation, 10 µl de la suspension ont été pipetés sur les lames de chambre de comptage de cellules Countess (Thermo Fischer Scientific, C10228) et la viabilité a été quantifiée à l'aide d'un compteur de cellules Countess II FL (Invitrogen de Thermo Fisher Scientific, AMQAF1000). La précision de la technique de mesure de la viabilité quantitative dissociée a été validée en comparant les valeurs à celles obtenues par analyse d'image de reconstructions 3D d'images confocales d'îlots intacts colorés par AO/PI.

Avant d'effectuer le test, les grappes d'îlots reçues ont été incubées dans un flacon de culture dynamique à 70 tr/min, 37 °C et 5 % de CO2. Les îlots ont été colorés avec 25 µl de 50 ng ml-1 de TMRE reconstitué, perchlorate (Biotium, 70005) à température ambiante pendant 1 min et 45 s sur des lames de microscope, recouverts d'une lamelle (Chase Scientific, ZA0294) et imagés à l'aide d'un Olympus Fluoview 3000 confocal microscope inversé (filtres d'excitation/émission : 594/574 nm). Les images ont été capturées à une résolution de 4 020 × 4 020 à l'aide d'un objectif de grossissement 20 ×. Le potentiel de membrane de l'îlot a été quantifié en mesurant l'intensité de fluorescence à l'aide du logiciel Olympus CellSens Dimension (v1.17).

Les îlots ont été incubés dans un flacon de culture dynamique à 70 tr/min, 37 ° C et 5 % de CO2 avant chaque essai. Des îlots de taille standard (~ 150 µm) ont été triés sur le volet et trois IEQ par puits ont été placés dans chaque puits de plaques noires à 96 puits (Greiner Bio-One, 89131-680) dans 50 µl de RPMI à 37 ° C. Ensuite, 50 µl de réactif de viabilité cellulaire Promega CellTiter-Glo 3D préchauffé ont été ajoutés à chaque puits. L'étalon ATP (Roche) a été utilisé comme contrôle positif et étalonné les résultats. La plaque a été scellée, recouverte d'une feuille d'aluminium et placée sur un agitateur orbital à température ambiante pendant 5 min à 80 tr/min. La plaque a ensuite été incubée à température ambiante pendant 25 min sans agitation. Un lecteur de microplaques multimode BioTek Synergy 2 a été utilisé pour capturer la luminescence, qui a été analysée à l'aide du logiciel BioTek Gen5 et rapportée en unités de lumière relative par IEQ.

Les îlots ont été incubés dans un flacon de culture dynamique à 70 tr/min, 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 3 h avant la réalisation du test. La respiration cellulaire a été mesurée à l'aide des plaques et grilles Agilent Seahorse XF Mito Stress Test et Agilent SeaHorse xFe24 Islet Capture FluxPak (Agilent, 103418-100). Les îlots ont été prélevés à la main dans des puits contenant 500 µl de milieu de culture en nombre suffisant pour couvrir 50 % du cercle intérieur de chaque puits d'échantillon. L'écran de capture d'îlots a été soigneusement et solidement fixé sur la plaque. Les îlots ont été lavés deux fois avec du milieu SeaHorse (SeaHorse XF DMEM) (Agilent, 103575-100) additionné de pyruvate 1 mM, de glutamine 2 mM et de glucose 5, 6 mM et équilibrés pendant 1 h à 37 ° C. Les réactifs du test ont été chargés dans une cartouche de capteur préalablement hydratée. La plaque d'essai a été insérée dans un analyseur Agilent SeaHorse xFe24 calibré, et le test Mito Stress a été effectué selon le protocole du fabricant avec les concentrations de réactifs optimisées suivantes : îlots de souris (5 µM d'oligomycine, 1 µM de FCCP et 10 µM de roténone et d'antimycine A ), îlots SC-bêta (10 μM oligomycine A, 2 μM FCCP et 10 μM chacun roténone et antimycine A), îlots humains (50 μM oligomycine A, 10 μM FCCP et 10 μM chacun roténone et antimycine A) et îlots porcins (50 µM oligomycine A, 2,5 µM FCCP et 10 µM chacun roténone et antimycine A). Les valeurs OCR ont été obtenues sur 200 min. Si le taux d'échantillonnage différait entre les plaques, le cours du temps a été mis à l'échelle sur la période d'observation standard.

Pour la normalisation entre les puits, les îlots de chaque puits ont été lysés dans de l'hydroxyde d'ammonium 1 M + 0,2 % de Triton X-100. La teneur en ADN a été mesurée par le test PicoGreen (Molecular Probes) en utilisant des contrôles d'étalonnage standardisés pour la quantification sur un lecteur de microplaques multimode BioTek Synergy 2 (BioTek). Les paramètres individuels de respiration cellulaire, y compris l'OCR pour la respiration basale, la production d'ATP, la fuite de protons, la respiration maximale, la capacité respiratoire de réserve et la respiration non mitochondriale, ont été calculés et normalisés à la teneur en ADN obtenue pour les puits individuels.

Les grappes d'îlots reçues ont été incubées dans un flacon de culture dynamique à 70 t/min, 37 °C et 5 % de CO2 avant la réalisation du test. Selon le protocole du fabricant, les cellules apoptotiques ont été colorées à l'aide du kit de détection d'apoptose in situ ApopTag Peroxydase (Millipore Sigma, S7100). Après coloration et lavage, la lame a été montée par déshydratation avec du xylène, et une lamelle a été appliquée à l'aide d'un milieu de montage. Le nombre de cellules apoptotiques dans chaque îlot a été compté au microscope optique.

Les grappes d'îlots reçues ont été incubées dans un flacon de culture dynamique à 70 t/min, 37 °C et 5 % de CO2 avant la réalisation du test. Ensuite, un tampon de liaison à l'annexine V 5 × (Biotium, 99902) a été dilué dans de l'eau désionisée pour obtenir un tampon de liaison 1 ×. Les îlots ont été lavés deux fois en utilisant un tampon de liaison 1X. La solution de coloration a été préparée en diluant le conjugué d'annexine V dans un tampon de liaison 1 × à une concentration finale de 2, 5 µg ml-1 et incubée avec les îlots à température ambiante pendant 15 à 30 min, à l'abri de la lumière. Les îlots ont ensuite été lavés trois fois avec un tampon de liaison 1 × et imagés dans les 30 minutes à l'aide du microscope inversé confocal Olympus Fluoview 3000 avec une excitation / émission de 490/515 nm sous un objectif 20 ×. La protéine de liaison aux phospholipides Ca 2 + avec une affinité élevée pour la phosphatidylsérine a été quantifiée en déclenchant la fluorescence de cartographie en fausses couleurs à l'aide du logiciel Olympus CellSens Dimension (v1.17) et analysée statistiquement.

Des tests GSIS ont été effectués pour évaluer la fonction in vitro des îlots26. En bref, les îlots ont été lavés deux fois dans du tampon Krebs Ringer (KRB) à faible teneur en glucose (glucose 3,3 mM) (NaCl 128 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2,7 mM, MgSO4 1,2 mM, Na2HPO4 1 mM, KH2PO4 1,2 mM, NaHCO3 5 mM, 10 mM HEPES et 0,1 % FAF-BSA dans de l'eau déminéralisée). Les îlots ont ensuite été chargés dans des inserts transwell à 24 puits (Millicell, insert de culture cellulaire, PIXP01250) et mis à jeun dans du KRB à faible teneur en glucose pendant 1 h à 37 ° C. Les îlots ont été lavés une fois dans du KRB à faible teneur en glucose, puis incubés dans du KRB à faible teneur en glucose pendant 1 h à 37 ° C. Le volume du KRB avec du glucose bas, du glucose haut et du KCl était de 1 ml par puits. Après incubation, le surnageant a été récupéré et stocké à -20 °C jusqu'à l'analyse. Les îlots ont ensuite été transférés dans du KRB à haute teneur en glucose (16,7 mM) pendant 1 h à 37 ° C, et le surnageant a été collecté et stocké. Les îlots ont ensuite été transférés dans du KRB à faible teneur en glucose avec 30 mM de KCl pour observer les conditions de dépolarisation et incubés dans ce tampon pendant 1 h, et le surnageant a été collecté. Enfin, les îlots ont été dispersés par incubation avec TrypLE et comptés à l'aide d'un compteur de cellules automatisé Countess (Thermo Fisher Scientific). Les surnageants collectés ont été analysés par dosage immuno-enzymatique pour les concentrations d'insuline humaine (ALPCO, 80-INSHUU-E01.1) et normalisés pour le nombre de cellules. L'insuline des îlots de souris a été mesurée par dosage HTRF (fluorescence homogène résolue dans le temps) (Cisbio PerkinElmer, 62IN1PEG).

Des souris C57BL/6 (mâles âgés de 6 à 8 semaines, Charles River Laboratories) ont été rendues diabétiques par injection intrapéritonéale d'une dose unique (220 mg kg-1) de streptozotocine (Millipore Sigma, S0130). La glycémie a été mesurée après 4 à 7 jours et le diabète a été confirmé par deux mesures quotidiennes successives de > 400 mg dl−1. Des greffes d'îlots de masse marginale de 250 îlots par receveur51 ont été réalisées sous la capsule rénale gauche de la souris receveuse. Pour tous les groupes de traitement, des îlots ont été sélectionnés au hasard pour la transplantation, y compris des îlots de toutes tailles, à la fois des îlots morphologiquement perturbés et des îlots intacts. Les mesures de glycémie ont été effectuées quotidiennement. Le succès de la greffe a été mesuré le premier jour de deux mesures quotidiennes successives de glycémie < 200 mg dl-1. L'échec de la greffe a été défini comme le premier jour de deux mesures consécutives > 250 mg dl-1.

Au jour 50 après la greffe, l'IPGTT a été réalisée en jeûnant des souris pendant 16 h (une nuit), puis en injectant 2, 5 g kg -1 de glucose par voie intrapéritonéale et en mesurant la glycémie toutes les 15 min pendant 150 min.

Pour confirmer que les îlots transplantés contrôlaient les niveaux de glycémie et non une restauration de la fonction des cellules bêta natives, une néphrectomie gauche (y compris la greffe d'îlots) a été réalisée pour un sous-ensemble de greffes au jour post-transplantation 60, et le retour de l'hyperglycémie a été vérifié. Les explants au jour 60 ont été fixés et colorés pour l'insuline et le glucagon.

Des îlots SC-bêta et porcins ont été transplantés sous la capsule rénale de souris mâles (NSG) non diabétiques âgées de 6 à 12 semaines (Jackson Laboratory)21. En bref, des grappes d'îlots contenant un total de 5 × 106 cellules ont été injectées sous la capsule rénale de souris NSG mâles. Les souris témoins ont subi une simulation de chirurgie au cours de laquelle une solution saline a été injectée dans la capsule rénale. Des saignements faciaux post-transplantation ont été effectués aux semaines 4, 8 et 12 pour mesurer les niveaux d'insuline humaine. À 14 semaines après la greffe, un IPGTT modifié a été réalisé. Les souris ont été mises à jeun pendant 16 h et du sang a été prélevé avant et 30 min après l'injection intrapéritonéale de 2,5 g kg-1 de bolus de glucose. Le sérum a été séparé du sang à l'aide de microvettes (Sarstedt, 20.1292.100) et l'insuline humaine a été quantifiée à l'aide du test immuno-enzymatique ultrasensible à l'insuline humaine (ALPCO, 80-INSHUU-E01.1). Après IPGTT, les reins contenant le greffon ont été explantés et colorés pour l'insuline et le glucagon.

Pour les xénogreffes d'îlots porcins, 350 îlots ont été transplantés sous la capsule rénale de souris NSG (mâles ou femelles, âgés de 6 à 12 semaines). 60 jours après la greffe, les reins contenant le greffon ont été retirés, fixés et colorés pour l'insuline et le glucagon.

Les reins récupérés avec des îlots transplantés sous la capsule rénale ont été fixés dans du formol alcoolique à 70 % (BBC Biochemical, 0460) et inclus dans des blocs de paraffine. Ensuite, des sections de 5 µm ont été découpées à l'aide d'un microtome. Les coupes ont été déparaffinées en utilisant du xylène et en diminuant les concentrations d'EtOH à 100 %, 90 %, 80 % et 70 %. Les lames ont été incubées avec un tampon de blocage (5 % d'albumine de sérum bovin (Millipore Sigma, B6917) dans du DPBS avec Ca2+ et Mg2+ (Thermo Fisher Scientific, 14040141)) pendant 20 min, puis colorées avec des réactifs spécifiques à l'espèce comme suit. Pour les expériences de viabilité spécifiques aux cellules bêta, des îlots de souris intacts ont été colorés avec un colorant mort vivant fixable (Biotium, Live-or-Dye NucFix) avant la fixation, la perméabilisation et la coloration avec des anticorps anti-insuline (voir ci-dessous).

Des coupes de rein ont été incubées à température ambiante avec l'anticorps anti-insuline polyclonal de cobaye FLEX (Agilent, IR002) pendant 1 h à température ambiante. Les sections ont été doucement lavées cinq fois en utilisant le tampon de blocage, puis incubées avec un anticorps anti-glucagon de lapin recombinant (Abcam, ab92517) dans un tampon de blocage (1:570) pendant 1 h. Les sections ont ensuite été lavées cinq fois doucement avec un tampon de blocage et incubées avec un anticorps secondaire d'immunoglobuline G (IgG) (H+L) de chèvre anti-cobaye (Alexa Fluor 488) (Abcam, ab150185 ; 1:250) et un anti-lapin de chèvre. IgG H&L (Alexa Fluor 647) (Abcam, ab150079) dans un tampon de blocage (1:250) pendant 1 h à température ambiante. Après avoir délicatement lavé les coupes avec du DPBS à 4 °C avec du Ca2+ et du Mg2+, les coupes ont été marquées avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (Millipore Sigma, F6057), couvertes (Chase Scientific, ZA0294) et placées à 4 °C pendant 2 h avant l'imagerie.

Des coupes de rein ont été incubées à température ambiante avec un anticorps monoclonal anti-insuline de souris (K36aC10) (Abcam, ab6995) dans un tampon de blocage (dilution 1:50) et un anticorps recombinant anti-glucagon de lapin (Abcam, ab92517) dans un tampon de blocage (1:570 ) pendant 1 h à température ambiante. Les coupes ont ensuite été rincées cinq fois doucement avec un tampon de blocage et incubées avec des IgG anti-souris de chèvre H&L (Alexa Fluor 647) (Abcam, ab150115) dans un tampon de blocage (1:250) et des IgG anti-lapin de chèvre H&L (Alexa Fluor 488) (Abcam, ab150077) dans un tampon de blocage (1:300) pendant 1 h à température ambiante. Après avoir lavé doucement les coupes avec du DPBS à 4 °C avec du Ca2+ et du Mg2+, les coupes ont été marquées avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (Millipore Sigma, F6057), couvertes (Chase Scientific, ZA0294) et maintenues à 4 °C pendant 2 h avant l'imagerie sur un microscope confocal inversé Olympus Fluoview 3000.

L'analyse statistique a été effectuée dans R version 4.0.3 (R Foundation for Statistical Computing). Nous avons inclus le nombre exact d'expériences indépendantes (n) et de répétitions techniques pour chaque figure pertinente dans le tableau supplémentaire 3. La normalité a été testée avec le test de Shapiro-Wilk pour les variables continues ou graphiquement à l'aide de graphiques qq et d'histogrammes de distribution. L'homogénéité de la variance a été évaluée à l'aide du test de Levene. Pour les comparaisons de groupe normales ou presque normales, un test ANOVA avec un test Tukey HSD post hoc par paires a été utilisé pour déterminer les différences statistiques. Pour les groupes à variance inégale, le test de Games-Howell a été utilisé. Les variables non normales ont été testées à l'aide du test non paramétrique de Kruskal-Wallis pour la signification globale et du test de Wilcox par paires (Mann-Whitney U) pour la comparaison de groupes individuels. Les valeurs P ont été ajustées pour les comparaisons multiples. L'analyse du délai avant l'événement a été effectuée à l'aide de la méthode de Kaplan-Meier avec le test de signification du log-rank. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, sauf indication contraire. Le traitement statistique complet pour chaque figure est présenté dans les données supplémentaires 2. Les tests statistiques étaient bilatéraux et une valeur P <0,05 était considérée comme significative.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données brutes ont été archivées pour un accès public (https://doi.org/10.13020/yrva-zr31)52.

La version 4.0.3 de R a été utilisée pour l'analyse statistique. MATLAB 2018b a été utilisé pour calculer les changements de volume des îlots à partir des vidéos de rétrécissement-gonflement enregistrées expérimentalement. MATLAB 2019a a été utilisé pour l'ajustement de la courbe de retrait-gonflement et l'évaluation de la fonction de coût de la toxicité chimique. Les codes personnalisés sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

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JSR a été soutenu par le Schulze Diabetes Institute et la Division de la transplantation du Département de chirurgie de l'Université du Minnesota. Les auteurs remercient F. Zhou et W. Zhang de l'installation de caractérisation de l'Université du Minnesota pour leur aide avec TEM et C. Forster et A. Lewis de l'Institut des sciences cliniques et translationnelles de l'Université du Minnesota pour l'assistance technique aux expériences d'histologie. Les auteurs reconnaissent Schulze Diabetes Institute, Département de chirurgie pour l'utilisation de leur microscope confocal et pour la fourniture d'îlots porcins. Ce travail est soutenu par des subventions de Regenerative Medicine Minnesota (EBF et JCB), de la National Science Foundation (EEC 1941543, JCB et EBF) et des National Institutes of Health (R01DK131209, JCB et EBF ; R01DK117425, JCB et EBF ; et R01HL135046, JCB et EBF). LZ reconnaît la bourse de thèse de doctorat de l'Université du Minnesota, et JCB reconnaît le soutien de la chaire Kuhrmeyer en génie mécanique et de la chaire Bakken de l'Institut d'ingénierie en médecine de l'Université du Minnesota. PPQ tient à remercier la Fondation JW Kieckhefer, la famille Stephen et Barbara Slaggie et la Fondation Khalifa Bin Zayed Al Nahyan pour leur soutien à ce travail.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Li Zhan, Joseph Sushil Rao.

Ces auteurs ont conjointement supervisé ce travail : John C. Bischof, Erik B. Finger.

Département de génie mécanique, Université du Minnesota, Minneapolis, MN, États-Unis

Li Zhan, Zonghu Han, Michael Etheridge, Cari S. Dutcher et John C. Bischof

Département de chirurgie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN, États-Unis

Joseph Sushil Rao, Diane Tobolt et Erik B. Finger

Schulze Diabetes Institute, Université du Minnesota, Minneapolis, MN, États-Unis

Joseph Sushil Rao

Département de génie chimique et des sciences des matériaux, Université du Minnesota, Minneapolis, MN, États-Unis

Nikhil Sethia et Cari S. Dutcher

Département de physiologie et de génie biomédical, Mayo Clinic, Rochester, MN, États-Unis

Michael Q. Slama et Quinn P. Peterson

Centre de médecine régénérative, Mayo Clinic, Rochester, MN, États-Unis

Quinn P. Peterson

Département de génie biomédical, Université du Minnesota, Minneapolis, MN, États-Unis

Jean-C Bishop

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LZ, JSR, JCB et EBF ont conçu et conçu l'étude. LZ, JSR, NS, MQS et DT ont réalisé des expériences et rassemblé les données. ZH, NS et LZ ont effectué la modélisation et assemblé les données. CSD, QPP, JCB et EBF ont coordonné et supervisé l'étude. JCB et EBF sont les co-auteurs. Tous les auteurs ont participé à la discussion et à l'interprétation des données. LZ, JCB et EBF ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Erik B. Finger.

LZ, JSR, ZH, NS, ME, CSD, JCB et EBF ont déposé une demande de brevet provisoire (n° de série 63/270 192) pertinente pour cette étude.

Nature Medicine remercie Gordon Weir, Klearchos Papas et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Jerome Staal et Jennifer Sargent ont été les principaux éditeurs de cet article et ont géré son processus éditorial et son examen par les pairs en collaboration avec le reste de l'équipe éditoriale.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Résultats supplémentaires et discussion, méthodes, figures 1 à 12, tableaux 1 à 3 et références.

Vidéo haute vitesse (4 000 images par seconde) du nanochauffage laser (impulsion laser de 7,5 ms) d'une gouttelette de 2 μl encapsulée avec des îlots.

Résumé du traitement statistique pour chaque figure, y compris les valeurs P, les statistiques de test et les intervalles de confiance.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Zhan, L., Rao, JS, Sethia, N. et al. La cryoconservation des îlots pancréatiques par vitrification permet d'obtenir une viabilité, une fonction, une récupération et une évolutivité clinique élevées pour la transplantation. Nat Med 28, 798–808 (2022). https://doi.org/10.1038/s41591-022-01718-1

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Reçu : 24 septembre 2021

Accepté : 26 janvier 2022

Publié: 14 mars 2022

Date d'émission : avril 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41591-022-01718-1

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