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Communications Biology volume 6, Article number: 508 (2023) Citer cet article

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Le virus adéno-associé (AAV) est un vecteur puissant pour la transduction génique in vivo et des applications thérapeutiques locales des AAV, comme pour les ulcères cutanés, sont attendues. La localisation de l'expression des gènes est importante pour la sécurité et l'efficacité des thérapies géniques. Nous avons émis l'hypothèse que l'expression des gènes pourrait être localisée en concevant des biomatériaux utilisant du poly(éthylène glycol) (PEG) comme support. Ici, nous montrons que l'un des transporteurs de PEG conçus a efficacement localisé l'expression des gènes à la surface de l'ulcère et réduit les effets hors cible dans la couche profonde de la peau et le foie, en tant qu'organe représentatif pour évaluer les effets hors cible à distance, en utilisant un modèle d'ulcère cutané de souris. . La dynamique de dissolution a entraîné la localisation de la transduction du gène AAV. Le support PEG conçu peut être utile pour des thérapies géniques in vivo utilisant des AAV, en particulier pour une expression localisée.

Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs puissants pour la transduction de gènes in vivo. Les AAV sont utilisés en clinique comme thérapies de remplacement pour traiter des affections telles que le déficit en lipoprotéine lipase, l'amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne et l'hémophilie1. Récemment, les applications possibles des AAV ont été élargies pour inclure les morbidités localisées2.

En raison des améliorations apportées à la fabrication, les doses moyennes d'AAV utilisées dans les essais cliniques augmentent. Cela permet l'utilisation de doses plus élevées résultant en des phénotypes plus forts ; cependant, la plupart des vecteurs AAV se retrouvent dans le foie et peuvent provoquer une toxicité à cet endroit et ailleurs3. Ainsi, le contrôle de la spécificité de l'expression génique - minimisant les effets hors cible - est très important dans le développement de thérapies utilisant les AVV. À ce jour, la spécificité a été contrôlée par la sélection et l'ingénierie du tropisme tissulaire/cellulaire de la capside d'AAV4, l'utilisation de promoteurs spécifiques aux tissus5,6 et la voie d'administration3.

Les plaies non cicatrisantes, telles que les plaies résultant d'ulcères de pression, d'ulcères diabétiques ou d'insuffisance vasculaire périphérique, sont préoccupantes dans les sociétés dont la population vieillit progressivement, et le transfert de gènes in vivo basé sur l'AAV devrait être une modalité thérapeutique utile7,8. Récemment, nous avons démontré que l'induction in vivo médiée par l'AAV de la reprogrammation des cellules mésenchymateuses résidant dans la plaie vers les cellules épithéliales permettait une épithélialisation de novo à partir de la surface des ulcères. Ces résultats ont constitué une première preuve de principe pour le développement futur de thérapies innovantes9,10.

Dans la recherche de méthodes cliniquement applicables pouvant améliorer la sécurité du transfert de gène médié par les AAV à la surface des ulcères cutanés, nous avons étudié le développement de matériaux pour la libération contrôlée des AAV à la surface des ulcères11, en utilisant du poly(éthylène glycol) ( PEG) comme support. Le PEG, qui est largement utilisé dans les biomatériaux en raison de sa nature bio-inerte, fonctionne comme un support en encapsulant ou en immobilisant un médicament ou un virus dans des vésicules et des hydrogels12,13. Les systèmes d'hydrogel injectables qui peuvent être administrés de manière peu invasive sur un site souhaité ont reçu une attention croissante pour l'administration contrôlée de virus en raison de leur capacité à passer d'une matrice hautement visqueuse à un liquide à faible viscosité14,15. Cependant, l'injection d'hydrogels liquides à faible viscosité peut provoquer la diffusion du virus encapsulé, c'est-à-dire une libération rapide en rafale du site d'injection, ce qui nuit potentiellement au traitement des infections virales localisées.

Nous avons émis l'hypothèse qu'un AAV encapsulé dans un support PEG avec une dégradabilité appropriée subirait une libération localisée à la surface des ulcères cutanés. Nous avons conçu un support PEG constitué d'un réseau de polymères réticulés dynamiquement (ci-après dénommé PEG slime) qui améliorait la spécificité de la transduction génique à la surface des ulcères avec des effets hors cible locaux ou distants réduits. L'utilisation de boue PEG très visqueuse démontre une nouvelle méthode de transduction génique hautement localisée.

Nous avons préparé trois types de matrices PEG comme supports possibles pour les AAV avec différentes réticulations et tailles de pores. Tous les PEG ont été formés par des protocoles similaires ; c'est-à-dire dissoudre des PEG tétrafonctionnels mutuellement réticulables et mélanger des volumes égaux des mêmes concentrations des précurseurs de PEG (Fig. 1a). (1) PEG hydrogel16 (Fig. 1b) : un hydrogel synthétique qui agit comme une matrice extracellulaire artificielle a été formé par la réticulation de PEG tétraarmé à terminaison propylamine (tétra-PEG-PA) et de PEG tétraarmé à terminaison succinimidylglutarate ( tétra-PEG-GS) via des liaisons amide, et les liaisons ester dans le tétra-PEG-GS ont permis à l'hydrogel d'être hydrolysable. (2) PEG sponge17 (Fig. 1c): un hydrogel PEG poreux dans lequel une structure à phases séparées a été obtenue en ajoutant du sulfate de potassium aux solutions précurseurs. (3) PEG slime18 (Fig. 1d): un liquide polymère viscoélastique préparé en mélangeant du PEG tétra-armé à terminaison D (+)-glucono-1,5-lactone (tétra-PEG-GDL) et du 4-carboxy-3- PEG tétra-armé à terminaison acide fluorophénylboronique (tétra-PEG-FPBA) pour former une réticulation réversible et fluctuante via des liaisons ester cycliques.

a Illustration schématique montrant le processus in situ d'administration d'AAV à une surface d'ulcère cutané à l'aide de porteurs de PEG. Les tétra-PEG, qui ont été fonctionnalisés avec des groupes mutuellement réticulables et dissous avec du PB contenant de l'AAV, ont été mélangés en volumes égaux, ce qui a entraîné la formation de porteurs de PEG encapsulant l'AAV. Les supports PEG préparés ont été administrés à la surface des ulcères cutanés sur le dos des souris, et l'AAV a été diffusé par la dissolution des supports PEG. b–d Préparation des supports PEG. Hydrogel PEG (b) préparé avec du tétra-PEG-PA et du tétra-PEG-GS, éponge PEG (c) préparée avec les mêmes précurseurs que l'hydrogel PEG, sauf que du sulfate de potassium dans du PB a été ajouté pour créer une structure à phases séparées. La boue PEG (d) a été préparée à partir de tétra-PEG-GDL et de tétra-PEG-FPBA pour obtenir un système réticulé dynamique. e Photographies de l'hydrogel PEG, de l'éponge PEG et de la boue PEG, montrant le comportement viscoélastique lors de la saisie. Les barres d'échelle représentent 5 mm. f Module de Young (E) en fonction du temps (t) de l'hydrogel PEG (triangles violets), de l'éponge PEG (losanges orange) et de la boue PEG (carrés bleus). E(t) a été normalisé par E à 0 s [E(0)]. g Photographies et images au microscope confocal à balayage laser de porteurs de PEG à l'état de préparation. Les barres d'échelle représentent 100 µm.

Malgré les similitudes dans les protocoles de synthèse, ces porteurs de PEG avaient des caractéristiques et des structures distinctes. La différence dans les propriétés mécaniques a été observée macroscopiquement sous compression : l'hydrogel et l'éponge de PEG ont montré une déformation complètement élastique, tandis que la boue de PEG a montré une perte progressive de la forme d'origine au fil du temps. Dans les observations grossières, une boue PEG préparée sous une forme sphérique pourrait conserver la forme lorsqu'elle est saisie avec une pince à épiler, semblable à un hydrogel peu de temps après la saisie. Cependant, la boue saisie est tombée plus tard sous forme de liquide très visqueux de la pince à épiler et a finalement pris une forme plate sur la table (Fig. 1e). La différence a ensuite été quantifiée par des tests de relaxation de contrainte, qui observent la dépendance temporelle du module de Young [E(t)] après avoir imposé une compression au support. Au fil du temps, la valeur E (t) a considérablement diminué pour la boue PEG, légèrement diminué pour l'éponge PEG en raison de l'extraction d'eau et était constante pour l'hydrogel PEG (Fig. 1f). La récupération de fluorescence après les mesures de photoblanchiment (FRAP) (Fig. 1 supplémentaire) a montré que l'intensité de fluorescence de la boue PEG était récupérée, indiquant que la relaxation des contraintes provenait des liaisons covalentes dynamiques entre GDL et FPBA. L'intensité de fluorescence de la boue PEG a été complètement récupérée ~ 60 s après le photoblanchiment, alors que celle de l'hydrogel PEG était inchangée. Ceci a confirmé le mouvement de translation des molécules constitutives du PEG slime et les réticulations dynamiques entre ces molécules. Les observations microscopiques des porteurs de PEG préparés avec des précurseurs de PEG marqués par fluorescence rouge (la fraction terminale des précurseurs de PEG a été partiellement modifiée avec un colorant fluorescent rouge comme décrit précédemment) ont indiqué des différences structurelles entre les porteurs. Dans l'éponge PEG, une structure d'île de mer où des cavités noires étaient dispersées dans l'image, avec des tailles de pores de l'ordre de grandeur de 10 µm, a été observée. Dans l'hydrogel PEG et la boue, aucune structure caractéristique n'a été observée, ce qui suggère que la taille du réseau était de l'ordre de grandeur du nm (Fig. 1g). La séparation des phases a été induite par l'ajout d'un sel inorganique, qui a diminué la solubilité du PEG, résultant en un hydrogel opaque. Au cours du processus de gélification, les précurseurs de PEG se connectent les uns aux autres, augmentant le poids moléculaire, ce qui entraîne la séparation de phases17. La concentration en sel a été choisie pour induire la séparation de phases lors de la gélification et non dans les solutions de précurseurs d'origine17.

Pour étudier en détail les différences de caractéristiques physiques des porteurs de PEG, nous avons effectué des analyses comparatives in vitro. Un modèle expérimental a été conçu pour faciliter la compréhension de la cinétique de dissolution. Des supports PEG marqués par fluorescence rouge ont été préparés sur des inserts de culture avec une taille de pores de 8, 0 µm (c'est-à-dire que des matériaux plus petits pouvaient passer à travers) (Fig. 2a). Pour l'évaluation détaillée des boues PEG, nous avons préparé une boue PEG conçue pour se dissoudre plus rapidement que la boue PEG standard (appelée boue molle PEG). Le taux de dissolution, calculé en mesurant l'intensité de fluorescence des échantillons élués passés à travers l'insert à des intervalles de temps prédéterminés, a été progressivement augmenté pour chaque échafaudage, et les taux de dissolution à 24 h (Déchantillon) étaient Dhydrogel = 19 %, Dsponge = 16 % , Dslime = 86 % et Dsoft-slime = 90 % (Fig. 2b). De plus, nous avons encapsulé des nanoparticules de silice fluorescente d'un diamètre de 30 nm en tant que matériaux modèles de diamètre similaire aux AAV et étudié le profil de libération des nanoparticules de silice fluorescente à partir des porteurs de PEG. Le comportement de libération des particules encapsulées dans chaque support a montré une tendance similaire à celle du comportement de dissolution, et les taux de libération à 24 h (Réchantillon) étaient Rhydrogel = 38 %, Rsponge = 33 %, Rslime = 75 % et Rsoft- slime = 92%, indiquant que la libération des nanoparticules était régie par la dissolution des porteurs (Fig. 2b). Un graphique du taux de dissolution par rapport au taux de libération (Fig. 2c) était linéaire pour les boues PEG. Cette forte corrélation a démontré que la libération des particules était régie par la dissolution des boues de PEG. Ce résultat a indiqué que les boues de PEG étaient des pseudo-solides, où la diffusion des particules était très limitée, mais les cargaisons pouvaient être éluées dans la solution à partir de la forme liquide.

a Illustration schématique montrant l'évaluation de la dissolution in vitro. Les photographies montrent la vue supérieure de l'insert. Les barres d'échelle représentent 5 mm. b Évaluation du temps de dissolution (symboles ouverts) et du taux de libération (symboles fermés) pour l'hydrogel PEG (triangles violets), l'éponge PEG (losanges orange), le slime PEG (carrés bleus) et le slime mou PEG (cercles rouges) préparés sur un insert de culture placé sur une plaque de culture. c Relation entre le taux de dissolution et le taux de libération.

Notamment, les taux de libération des boues PEG étaient presque constants pendant 7 h ; c'est-à-dire qu'une cinétique de libération idéale d'ordre zéro a été atteinte. Ce résultat était dû au fait que l'élution, qui régit la libération des particules, était approximativement d'ordre zéro car elle ne se produisait qu'à travers la membrane. En revanche, la libération des particules de l'hydrogel PEG et de l'éponge n'était pas corrélée avec une région à taux de libération élevé. Ce résultat était dû au fait que ces supports étaient solides et que les particules étaient principalement libérées par diffusion.

Pour la thérapeutique des plaies, les méthodes de transduction génique hautement spécifiques à la surface des ulcères sont privilégiées. Pour étudier les effets des porteurs de PEG sur la transduction génique avec un AAV pour le traitement des ulcères cutanés, des ulcères cutanés isolés qui simulaient la partie centrale d'un grand ulcère cutané ont été utilisés10. Nous avons enlevé chirurgicalement la peau du dos des souris pour générer un ulcère et isolé la plaie résultante de la peau environnante à l'aide d'une chambre en silicone suturée au fascia profond19,20 (Fig. 2a supplémentaire). En isolant la plaie de la peau environnante à l'aide de la chambre, nous pouvons étudier les phénomènes à la surface de l'ulcère sans interférence de la peau environnante, tels que l'épithélialisation et la contraction de la plaie. GFPNLS-AAVDJ [un type d'AAV optimisé pour les cellules des ulcères cutanés10 codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) avec un signal de localisation nucléaire (NLS)] a été mélangé avec les porteurs de PEG et inoculé sur l'ulcère. Nous avons utilisé le nombre de cellules positives plutôt que le centile car nous avons considéré que le premier serait plus approprié pour les analyses histologiques des tissus d'ulcères cutanés, qui se composaient de types hétérogènes de cellules avec des marges indéfinies. Nous avons testé différents titres du virus dans du PBS (Fig. 2b supplémentaire) et observé la surface de l'ulcère avec un microscope à fluorescence au fil du temps (jusqu'au jour 13) (Fig. 2c supplémentaire) et des ulcères 72 h après l'administration de 1010 copies de gène ( GC) de virus ont été sélectionnés pour une analyse quantitative (Fig. 3a). Les observations des surfaces de l'ulcère avec un stéréoscope fluorescent ont indiqué que les cellules GFPNLS-positives étaient plus fréquemment observées chez les animaux traités avec des AAV encapsulés dans de la boue PEG, de la boue molle PEG ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) que celles dans l'hydrogel PEG ou l'éponge PEG. (Fig. 3b, c).

a Administration de GFPNLS-AAVDJ (sérotype AAV-DJ, 1 × 1010 GC par souris) encapsulé dans des supports PEG sur une surface brute créée dans une chambre en silicone de 1 cm de diamètre fixée sur le dos des souris. b Cellules GFP-positives représentatives sur des souris ulcères de la peau 72 h après l'administration, observées au microscope stéréoscopique. Barre = 2 mm. c Nombre de cellules GFP-positives exprimées superficiellement, 72 h après l'administration de chaque porteur contenant AAV. Le diagramme de points superposé indique la distribution des données. Un nombre significativement plus élevé de cellules GFP-positives superficielles a été observé avec le PEG slime ou soft-slime, par rapport aux autres porteurs de PEG. Aucune différence significative n'a été détectée entre le PEG slime ou soft-slime et le PBS. * < 0,05, ** < 0,01 (n = 3). d Tranches représentatives montrant une infection par AAV-GFPNLS 72 h après l'administration, de formulations PEG slime et PBS. De nombreuses cellules GFP-positives ont été observées dans la couche profonde lorsque l'AAV-GFPNLS a été administré avec du PBS, alors que la plupart des cellules GFP-positives ont été trouvées dans la couche superficielle après administration avec de la boue PEG. Les lignes pointillées indiquent la marge entre les couches superficielles et profondes. Barre = 500 µm. e Nombre de cellules GFP-positives dans la couche superficielle (au-dessus du tissu sous-cutané) et dans la couche profonde (jusqu'au tissu musculaire) chez chaque animal. Le diagramme de points superposé indique la distribution des données. Notez que la boue PEG a empêché l'infection des tissus profonds de manière significative, mais il n'y avait pas de différences significatives entre les formulations dans le nombre de cellules GFP-positives dans la couche superficielle. * < 0,05 (n = 5).

Alors que l'encapsulation de l'hydrogel PEG et de l'éponge PEG réduisait l'efficacité de la transduction génique à la surface des ulcères cutanés, l'encapsulation de la boue PEG a conservé l'efficacité de transduction d'origine observée avec le PBS. Les boues PEG ont été utilisées pour une évaluation histologique plus poussée en mettant l'accent sur la spécificité de la transduction génique dans la couche superficielle des ulcères cutanés. Les ulcères traités avec des GFPNLS-AAVDJ formulés avec du PEG slime, du PEG soft-slime et du PBS ont été préparés et analysés histologiquement pour le nombre de cellules GFPNLS-positives dans les couches superficielles (granulation et tissu adipeux) et profondes (fascia et muscle) (Fig. 3d et Supplémentaire Fig. 2a). En accord avec les résultats de l'évaluation stéréoscopique, aucune différence significative n'a été trouvée dans le nombre de cellules positives dans les couches superficielles des animaux traités avec PEG slime, PEG soft-slime ou PBS. En revanche, le nombre de cellules GFPNLS-positives dans les couches profondes a diminué de manière significative chez les animaux traités à la boue PEG, par rapport aux souris traitées au PBS, et le degré de réduction était plus élevé chez les animaux traités à la boue PEG, par rapport au PEG. souris traitées à la bave molle (Fig. 3e). Pour étudier plus avant les différences possibles dans l'efficacité de la transduction génique en termes de multiplicité de transduction génique, des mélanges de deux AAV de couleur fluorescente différente (GFPNLS-AAVDJ et mCherryNLS-AAVDJ) ont été administrés à la surface de l'ulcère, et la fréquence du gène dupliqué la transduction a été mesurée (Fig. 3a supplémentaire). Le nombre de transductions de gènes dupliqués était cohérent entre PBS et PEG slime, indiquant en outre qu'il n'y avait pas de différences significatives chez les souris traitées avec PEG slime et PBS en termes de multiplicité de transduction de gènes (Fig. 3b supplémentaire). Étant donné que l'utilisation d'un transporteur de boue PEG améliorait l'efficacité locale, spécifique à la couche, de la transduction génique, par rapport aux autres transporteurs, nous avons étudié plus en détail les effets éloignés hors cible de ce transporteur.

Le tropisme des cellules AAV diffère selon les sérotypes, et donc l'importance de chaque organe en tant que cible éloignée dépend du sérotype. Auparavant, nous avons évalué la distribution de l'AAVDJ dans divers tissus organiques après l'injection de luciférase-AAVDJ et avons constaté que l'expression de la luciférase est principalement confinée au foie10. Pour étudier l'influence possible de l'encapsulation de la boue PEG, l'expression de GFPNLS hors cible dans le foie a été évaluée 28 jours après l'inoculation des ulcères avec le vecteur AAVDJ dans un support de boue PEG, ou PBS, dans une chambre cutanée. Un petit nombre de cellules GFPNLS-positives ont été observées à la surface du foie à l'aide d'un stéréoscope (Fig. 4a). Une comparaison quantitative utilisant la qPCR des titres d'AAV dans le foie a indiqué que les copies génomiques étaient significativement réduites avec l'utilisation du support de boue PEG, par rapport au PBS (Fig. 4b). Ainsi, l'utilisation d'un support de boue PEG a le potentiel de réduire les effets éloignés hors cible.

un GFPNLS-AAVDJ (sérotype AAV-DJ, 5 × 1010 GC par souris) encapsulé dans de la boue PEG ou dilué avec du PBS a été administré sur une surface brute créée sur le dos des souris. Après 4 semaines, le foie a été prélevé pour une analyse quantitative, y compris des évaluations qPCR. Il n'y avait pas suffisamment de cellules GFP-positives pour l'analyse statistique. La tête de flèche remplie indique une cellule GFP-positive observée dans le foie à l'aide d'un stéréoscope. Barre noire et blanche = 5 mm, barre rouge = 500 µm. b L'ADN génomique a été extrait de six lobes de chaque foie récolté pour évaluer les taux d'infection par l'AAV. Les titres d'AAV ont été significativement diminués dans le groupe visqueux. (n = 7) * <0,05.

Grâce à une série d'expériences in vivo, les boues de PEG se sont révélées être des supports utiles pour la transduction du gène AAV spécifique à la surface, tandis que les supports d'éponge PEG et d'hydrogel PEG réduisaient l'efficacité de transduction du gène, par rapport au PBS. Nous pensons que ces différences étaient liées aux profils de libération des boues de PEG tels que déterminés dans les évaluations in vitro décrites ci-dessus. Pour élucider les propriétés mécanistes possibles spécifiques à la boue PEG, des AAV21,22,23 marqués par fluorescence ont été suivis et nous avons constaté qu'une détection fiable était difficile en raison des faibles signaux de fluorescence par rapport aux signaux de fond (Fig. 4a – c supplémentaires). Au lieu de cela, le comportement des nanoparticules de silice à la surface des ulcères cutanés a été étudié. Dans l'essai initial, des nanoparticules de silice fluorescentes vertes (d'un diamètre de 30 nm, similaire à celui des AAV24) dans du PBS ont été inoculées. Les nanoparticules ont d'abord été localisées dans la couche superficielle puis diffusées dans les couches profondes, comme les tissus adipeux et musculaires, avec le temps. Il est important de noter que seules quelques particules sont restées à la surface de l'ulcère à 24 h (Fig. 5 supplémentaire). En conséquence, 24 h ont été utilisées comme période expérimentale pour l'analyse quantitative suivante de l'influence du support PEG sur la dissolution du PEG et la libération des nanoparticules de silice.

Des nanoparticules de silice fluorescentes vertes ont été mélangées à des supports PEG ou PBS, puis inoculées sur un ulcère (Fig. 5a). Avec les supports PEG, plus de nanoparticules de silice sont restées sur la couche superficielle à 24 h, par rapport au PBS. Cet effet était plus important pour le PEG slime et le PEG soft-slime qu'avec l'hydrogel PEG et l'éponge PEG (Fig. 5b, c). La distribution prolongée spécifique à la surface des nanoparticules de silice utilisant un support de boue PEG pourrait être associée à la transduction du gène AAV spécifique à la surface.

a Administration de nanoparticules de silice fluorescentes encapsulées dans des supports PEG sur la surface brute créée sur le dos des souris. Des supports d'hydrogel et d'éponge PEG ont été injectés dans la chambre, tandis que de la boue PEG a été insérée car la boue n'a pas pu être injectée. Le toit de la chambre en silicone fixée a été ouvert pour observation 24 h après l'administration. b Comparaison de la diffusion des particules des porteurs de PEG, 24 h après l'administration. Images représentatives d'un stéréoscope et tranches. Notez que les particules administrées avec du PEG slime étaient concentrées sur la surface de l'ulcère, alors que les particules étaient diffusées dans les muscles lorsqu'elles étaient administrées avec du PBS. Barre = 1 mm. c Le nombre de nanoparticules de silice fluorescentes dans la couche superficielle. Le diagramme de points superposé indique la distribution des données. Avec PEG slime et soft-slime, le nombre de nanoparticules fluorescentes dans la couche superficielle a augmenté de manière significative. (n = 3) * <0,05, ** <0,01, *** <0,001.

Avec la boue PEG, le nombre de nanoparticules de silice dans la couche superficielle a augmenté, bien que la transduction génique médiée par l'AAV dans la couche superficielle n'ait pas augmenté. Nous avons considéré que cet écart pourrait résulter de la désintégration des AAV dans le PEG au fil du temps.

Pour déterminer les effets possibles du temps de stockage à température corporelle et de la solution de solvant sur la capacité de transduction génique des AAV, nous avons testé la capacité de transduction génique des AAV conservés pendant 0, 3, 6, 12, 18 et 24 h à 37 ° C avec ou sans sérum sanguin de souris in vitro (Fig. 6a). Lorsque les AAV ont été maintenus à 37 ° C pendant 3 à 18 h en l'absence de sérum, la capacité de transduction génique des AAV s'est progressivement réduite à un dixième de la capacité d'origine. En revanche, lorsque les AAV étaient conservés pendant 24 h avec du sérum, la capacité de transduction génique des AAV était maintenue (Fig. 6b). La capacité de transduction génique des AAV dans la boue PEG, formulée avec du PEG et du PBS, pourrait diminuer avec le temps, alors que cette réduction pourrait être atténuée une fois que les AAV ont été libérés de la boue PEG. Au fil du temps, la désintégration des AAV dans le PEG pourrait contribuer à l'écart dans le comportement des nanoparticules de silice et l'efficacité de la transduction des gènes dans la couche superficielle.

a L'efficacité de la transduction génique de GFPNLS-AAVDJ conservée pendant 0, 3, 6, 12, 18 et 24 h à 37 ° C avec ou sans sérum sanguin de souris a été testée sur des cellules stromales dérivées de la graisse de souris (mASC) in vitro. b La capacité de transduction génique de GFPNL-AAV a progressivement diminué après stockage à 37 ° C en l'absence de sérum, alors qu'elle était constante après stockage pendant 24 h avec du sérum. Le diagramme de points superposé indique la distribution des données. (n = 4).

Dans la présente étude, divers porteurs de PEG ont été évalués à l'aide d'un modèle d'ulcère cutané in vivo. La boue de PEG a réussi à localiser l'expression génique à la surface de l'ulcère, avec une réduction significative de l'expression génique à la fois dans la couche musculaire profonde et dans le foie, par rapport aux autres porteurs étudiés.

Pour étudier la cinétique détaillée des AAV, un marquage fluorescent a été utilisé. Cependant, un traçage fiable était difficile en raison des faibles signaux de fluorescence par rapport aux signaux de fond. Alternativement, nous avons utilisé des nanoparticules de silice car chaque particule présentait une forte fluorescence et pouvait être tracée de manière fiable dans des échantillons de tissus d'ulcères cutanés. La possibilité que les nanoparticules d'AAV et de silice ne présentent pas le même comportement est une limitation fondamentale de l'étude actuelle.

L'efficacité de la transduction génique in vivo différait entre les différents porteurs de PEG. Cette différence a été attribuée aux mécanismes de dissolution résultant des différentes formes de réticulation. Dans les hydrogels et éponges PEG, toutes les molécules étaient reliées par des liaisons irréversibles. Ainsi, ces supports avaient des propriétés caractéristiques des solides ; la caractérisation in vitro a montré qu'ils présentaient un module d'élasticité fini sous une contrainte constante (Fig. 1f). L'évaluation in vitro des taux de dissolution du PEG et des taux de libération des particules a montré qu'il y avait une réduction significative des deux taux lorsque des hydrogels et des éponges étaient utilisés, par rapport aux autres supports, ce qui suggérait que les nanoparticules étaient piégées dans les réseaux (Fig. 2b) .

En général, les matériaux polymères solides, tels que les hydrogels PEG et les éponges, sont considérés comme se dégradant de manière homogène, ce qui est appelé dégradation en masse, plutôt que de se dégrader progressivement à partir de la surface25,26,27. En d'autres termes, la scission de chaîne se produit de manière homogène dans le temps par hydrolyse. Finalement, lorsque la connectivité du réseau tombe en dessous d'un certain niveau, les hydrogels et éponges PEG passent d'un solide à un liquide. Par conséquent, on pense que les hydrogels et les éponges PEG ont une libération de particules réduite, par rapport aux autres supports, car ils pénètrent dans les tissus avec des particules AAV piégées tout en se dégradant (Fig. 7a). Des expériences de particules fluorescentes pour évaluer le mouvement physique des nanoparticules ont montré que les hydrogels et les éponges entraînaient un nombre réduit de particules dans la couche superficielle des ulcères (Fig. 5b, c), par rapport aux boues PEG.

un hydrogel de PEG ou des supports spongieux encapsulant des AAV ont été préparés en mélangeant des précurseurs gélifiants de tétra-PEG portant aux extrémités des groupes succinimidylglutarate (tétra-PEG-GS) et propylamine (tétra-PEG-PA), qui ont été mutuellement réticulés par condensation pour former un amide liens, qui sont des liens irréversibles. Les groupes ester introduits à l'origine dans le tétra-PEG-GA ont été introduits entre les molécules de PEG, qui sont finalement hydrolysées pour dégrader l'hydrogel ou l'éponge. Le processus de dégradation peut se dérouler de manière homogène dans ces supports, appelé dégradation en masse, plutôt qu'une dégradation progressive à partir de la surface. Au fur et à mesure de la dégradation des porteurs, les AAV encapsulés diffusent vers les couches superficielles ou profondes et infectent les cellules environnantes. b La boue PEG a été préparée en mélangeant des solutions aqueuses de tétra-PEG à terminaison diol ou acide boronique (tétra-PEG-GDL et tétra-PEG FPBA), qui ont été mutuellement réticulés par une réaction d'ester cyclique pour former des liaisons de coordination, qui sont réversibles obligations. La réticulation réversible a doté la matrice PEG d'une propriété hautement viscoélastique, faisant de la matrice un liquide. Ce liquide PEG pourrait être de forme variée pour couvrir un ulcère cutané et encapsule les AAV sans diffuser à travers les couches de la peau. La boue PEG diffuse dans la couche superficielle, plutôt que d'être dégradée, à partir de l'interface entre la boue et l'ulcère cutané. Comme la boue PEG peut pénétrer dans la couche superficielle, la boue PEG est gonflée et diluée, entraînant une infection dans les cellules environnantes, ce qui entraîne une réduction de l'expression des gènes hors cible distants dans le foie. c AAV administré avec du PBS diffusé rapidement. La puissance de transduction du gène n'est pas endommagée tant que l'AAV n'a pas atteint les couches profondes. Par conséquent, l'AAV infecte efficacement les couches superficielles et profondes.

Les particules d'AAV nécessitent un contact direct avec les cellules pour réussir l'infection par endocytose6. Par conséquent, l'infection par l'AAV a été supprimée lorsque les particules d'AAV ont été piégées dans un réseau PEG car il n'y avait pas de contact direct avec les cellules. En d'autres termes, les particules d'AAV non libérées ne sont pas infectieuses, ce qui a entraîné une diminution de l'expression de la GFP à la surface de l'ulcère après l'administration d'AAV à l'aide d'un hydrogel ou d'une éponge PEG.

En revanche, les molécules étaient connectées par des liaisons réversibles dans la boue PEG, entraînant un équilibre entre la liaison et la dissociation des molécules (Fig. 1 supplémentaire). Le module d'élasticité de la boue a diminué et atteint zéro au fil du temps (Fig. 1f), indiquant que la boue était un liquide d'un point de vue thermodynamique. Par conséquent, la boue de PEG appliquée à la surface de l'ulcère pourrait se diffuser sous forme de liquide et s'infiltrer de la surface de l'ulcère dans les tissus profonds ; Le slime PEG et le PBS ont été considérés comme équivalents en termes de diffusion de support et d'AAV.

La boue PEG a montré des caractéristiques notables qui différaient du PBS. Les taux de dissolution et de libération de la boue étaient inférieurs à ceux utilisant du PBS (Fig. 2b), et les taux de dissolution et de libération au fil du temps étaient presque identiques (Fig. 2c). Ces résultats indiquent que les particules ont été libérées en même temps que la dissociation locale du PEG dans la boue. Les nanoparticules contenues dans la boue PEG étaient confinées à la surface de l'ulcère après l'application (Fig. 5b), limitant la pénétration de l'interstitium vers les tissus plus profonds, ce qui peut être dû au fait que la boue est restée plus longtemps à la surface de l'ulcère que le PBS. En d'autres termes, contrairement aux hydrogels et aux éponges de PEG de type solide, les particules de la boue de PEG de type liquide se sont diffusées par translation27 et l'infection par l'AAV s'est produite principalement à la surface de l'ulcère où se trouvait la boue de PEG (Fig. 7b).

La boue PEG était plus localisée pendant l'infection virale que la boue molle PEG, qui avait une viscoélasticité plus faible, entraînant une infection profonde principalement réduite en utilisant la boue PEG (Fig. 3e). Étant donné que les infections locales de la couche profonde hors cible étaient limitées, l'expression hors cible dans le foie a également diminué.

Dans des rapports précédents, la thérapie génique avec des vecteurs viraux utilisant des porteurs a entraîné une suppression du taux de libération de vecteurs viraux par les porteurs. Par exemple, un lentivirus avec un hydrogel et des analogues a permis de prolonger l'activité locale in vitro27 et in vivo28 ; un adénovirus porté avec de la fibrine avait une bioactivité accrue et une demi-vie prolongée in situ29 ; et un AAV avec de la gélatine avait une concentration locale accrue de la substance bioactive30.

Le comportement des nanoparticules de silice à la surface des ulcères cutanés avec ou sans porteurs de PEG a indiqué l'utilité potentielle des porteurs de PEG dans l'administration d'autres types de médicaments et de biomolécules. L'élucidation d'autres comportements, tels que la dépendance à la dose ainsi que la diffusion, la biodistribution et la clairance en fonction du temps des substances administrées par voie sous-cutanée, devrait être effectuée dans de futures études.

La boue PEG pourrait augmenter la quantité absolue de particules AAV administrées dans la couche superficielle, bien que cette augmentation ait été annulée par la désintégration des AAV dans le PEG au fil du temps, réduisant ainsi le nombre de cellules positives dans les couches plus profondes ainsi que le nombre total de cellules positives . En conséquence, le support tétra-PEG développé dans la présente étude n'a pas amélioré de manière significative l'activité locale. La transduction génique était localisée dans la couche superficielle de la peau et il y avait une atténuation significative des effets hors cible.

Nous avons décrit une nouvelle technologie pour générer des tissus épithéliaux extensibles via la reprogrammation directe des cellules mésenchymateuses résidentes de la plaie, ce qui permet à toutes les régions de la plaie de se réépithélialiser sans les contraintes spatiales observées lors de la cicatrisation normale9,10. La transduction de facteurs de reprogrammation induit potentiellement une reprogrammation directe des cellules non épithéliales en cellules épithéliales et donc la formation de tissus épithéliaux ectopiques à des sites autres que la couche superficielle des ulcères cutanés. De plus, il est souhaitable de minimiser les réactions indésirables potentielles que le transgène peut induire dans des organes distants.

Dans notre première étude de preuve de concept, aucun effet indésirable n'a été détecté chez le nombre limité de petits animaux. Néanmoins, toutes les mesures possibles doivent être prises pour le développement ultérieur vers des applications cliniques. Nous considérons que les découvertes actuelles pourraient être utiles non seulement pour le développement de la thérapie génique contre les ulcères cutanés, mais également pour tout type de développements thérapeutiques localisés et donc censés avoir des effets extrêmement puissants.

Les autres limites de la présente étude résident dans les différences entre les structures cutanées humaines et de souris31. Les principales différences incluent l'épaisseur des composants en couches, tels que le derme et le tissu adipeux sous-cutané, l'absence de glandes sudoripares chez la souris et la présence de la fine couche musculaire connue sous le nom de Panniculus carnosus dans la peau du dos de la souris. Ces différences pourraient ne pas influencer considérablement les résultats de l'étude actuelle car les expériences ont été réalisées avec l'ulcère cutané dans une chambre en silicone. Néanmoins, une interprétation prudente des résultats est nécessaire lors des applications cliniques. L'autre limite réside dans le modèle expérimental. L'administration d'AAV liquides dans une chambre fermée est complètement différente des administrations réelles en milieu clinique, qui impliquent l'application directe de la solution sur la surface de la plaie ouverte. L'utilisation de liquides viscoélastiques comme support d'AAV pourrait être avantageuse pour réduire l'excrétion d'AAV32, bien qu'elle n'ait pas pu être déterminée expérimentalement.

L'utilisation de PEG slime, qui est un liquide hautement viscoélastique, comme support pour les AAV a entraîné une expression génique localisée dans la couche superficielle de l'ulcère cutané et réduit les effets hors cible, par rapport à d'autres supports et à un contrôle PBS. La libération contrôlée utilisant le support PEG développé dans la présente étude ouvre la voie à de futures thérapies géniques localisées.

Le tétra-PEG-PA et le tétra-PEG-GS (Mw = 20 kg mol-1) (NOF Corporation, Japon) ont été utilisés sans autre purification. Le poly(éthylène glycol) fonctionnalisé avec une amine primaire (Mw = 20 kg mol-1) (tétra-PEG-NH2) (SINOPEG, Chine) a été utilisé sans autre purification. Sulfate de potassium (K2SO4), méthanol super déshydraté, diméthylsulfoxyde super déshydraté, GDL, FPBA, triéthylamine (TEA), 4-(4,6-diméthoxy-1,3,5-triazine-2-yl)-4- du chlorure de méthylmorpholinium n-hydraté (DMT-MM) et une solution tampon de phosphate de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Japon) ont été utilisés sans autre purification. L'ester Alexa FluorTM 594 NHS (ester de succinimidyle) (Alexa-NHS) et la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) (Thermo Fisher Scientific, USA) ont été utilisés sans autre purification. Un tampon phosphate (pH 7,4 ; PB) a été préparé à une concentration de 200 mM. RC15-AC (Sartorius, Allemagne), ARVO™ X3 (PerkinElmer, États-Unis) et LSM 800 (ZEISS, Allemagne) ont été utilisés comme filtre 0,22 μm, lecteur de microplaques et microscope confocal à balayage laser (CLSM), respectivement, dans toutes les expériences. L'eau Milli-Q a été utilisée comme eau tout au long de l'étude.

Le tétra-PEG-GDL et le tétra-PEG-FPBA ont été synthétisés en couplant les molécules pertinentes au tétra-PEG-NH2 selon un précédent rapport18. Pour le tétra-PEG-GDL, le tétra-PEG-NH2 (1000 mg, 0,05 mmol), le GDL (89 mg, 0,5 mmol, 10 équiv. de tétra-PEG-NH2) et le TEA (50 mg, 0,5 mmol, 10 équiv. . de tétra-PEG-NH2) ont été dissous dans 30 ml de méthanol sur-déshydraté. Le mélange a été agité et incubé pendant 3 jours à 35°C. La solution mélangée a ensuite été dialysée contre un excès de méthanol et d'eau pendant 24 h chacune à l'aide d'une membrane de dialyse Spectra/Por® (MWCO : 6000–8000 Da, Spectrum Laboratories, Grèce). La solution a été filtrée avec un filtre de 0,45 µm et lyophilisée pour obtenir du tétra-PEG-GDL (rendement : 900 mg). Le polymère obtenu a été caractérisé par 1H-RMN (Bruker Avance DPX-400 MHz, USA) en utilisant D2O comme solvant.

Pour la synthèse de tétra-PEG-FPBA, tétra-PEG-NH2 (1000 mg, 0,05 mmol), FPBA (91 mg, 0,5 mmol, 10 équiv. de tétra-PEG-NH2) et DMT-MM (138 mg, 0,5 mmol, 10 équiv. de tétra-PEG-NH2) ont été dissous dans 30 ml de méthanol super déshydraté. Le mélange a été agité et incubé pendant 3 jours à 35°C. La solution mixte a ensuite été dialysée avec un excès de HCl 10 mM aq., 10 mM NaOH aq., un tampon phosphate (pH 7,4, 10 mM), 100 mM NaCl aq. et de l'eau distillée pendant 24 h chacun en utilisant une membrane de dialyse. La solution a été filtrée avec un filtre de 0,45 µm et lyophilisée pour obtenir du tétra-PEG-GDL (rendement : 900 mg). Le polymère obtenu a été caractérisé par 1H-RMN en utilisant D2O comme solvant.

L'hydrogel PEG, l'éponge PEG et la boue PEG ont été préparés en dissolvant des tétra-PEG mutuellement réticulables et en mélangeant les mêmes volumes de tétra-PEG. Ces supports PEG ont été réticulés en utilisant les précurseurs suivants. (1) Hydrogel PEG : le tétra-PEG-PA et le tétra-PEG-GS ont été dissous séparément dans du PB pour donner la concentration de PEG (CPEG) = 60 g l-1. (2) Éponge PEG : le tétra-PEG-PA et le tétra-PEG-GS ont été dissous séparément dans du PB avec 250 mM de K2SO4 pour obtenir CPEG = 60 g l-1. (3) Boue de PEG : le tétra-PEG-GDL et le tétra-PEG-FPBA ont été dissous séparément dans du PB pour obtenir CPEG = 60 g l-1.

Le tétra-PEG-PA et le tétra-PEG-GDL marqués par fluorescence rouge ont été préparés pour visualiser la structure interne des échafaudages PEG. Pour le tétra-PEG-PA, 1000 mg de tétra-PEG-PA ont été dissous dans 20 ml d'eau distillée et agités pendant 10 min à température ambiante. Séparément, 1 mg d'Alexa-NHS a été dissous dans 1 ml de diméthylsulfoxyde super déshydraté et 16 µl (0,01 équiv. de tétra-PEG-PA) ont été ajoutés à la solution de tétra-PEG-PA. La solution mélangée a été incubée à température ambiante pendant 3 h, puis dialysée contre un excès d'eau distillée pendant 3 h pour éliminer les molécules n'ayant pas réagi, et lyophilisée pour obtenir du tétra-PEG-PA marqué partiellement avec une fluorescence rouge, sous forme de poudre rouge clair ( rendement : 950 mg). Le tétra-PEG-PA et le tétra-PEG-GS marqués par fluorescence rouge ont été dissous dans du PB avec des concentrations de K2SO4 = 0 et 300 mM pour obtenir CPEG = 60 g l-1. Ces deux précurseurs ont été mélangés dans le même volume, coulés dans un moule cylindrique en silicone (diamètre : 5 mm et hauteur : 1 mm), et incubés à 25 °C pendant 24 h. Les échantillons obtenus ont été observés à l'aide d'un CLSM.

Pour la synthèse du tétra-PEG-GDL, avant la réaction du GDL avec le tétra-PEG-NH2, 1000 mg de tétra-PEG-NH2 ont été dissous dans 20 ml de méthanol sur-déshydraté. Seize microlitres (0,01 équiv. de tétra-PEG-NH2) d'Alexa-NHS ont ensuite été ajoutés à la solution et la solution a été incubée pendant 24 h à température ambiante. GDL et TEA ont ensuite été ajoutés à la solution mixte selon le procédé décrit pour la préparation de tétra-PEG-GDL. Le tétra-PEG-GDL et le tétra-PEG-FPBA marqués par fluorescence rouge ont ensuite été dissous dans du PB pour obtenir CPEG = 60 g l-1. Ces deux précurseurs ont été mélangés dans le même volume, versés dans un moule cylindrique en silicone et incubés à 25 ° C pendant 24 h, suivis d'une observation à l'aide d'un CLSM.

Des précurseurs de PEG marqués par fluorescence rouge pour PEG hydrogel et PEG slime ont été versés dans un moule cylindrique en silicone (diamètre : 5 mm et hauteur : 1 mm) et incubés à 25 °C pendant 24 h. Sous CLSM, les porteurs de PEG incubés ont été blanchis avec un cercle de 20 µm pendant 1 s, et la récupération de l'intensité de fluorescence a été observée.

Un système de modèle in vivo, utilisant un ulcère cutané à la surface du dos de souris, a été conçu avec un insert de culture cellulaire à 12 puits (taille des pores de 8,0 µm) (Becton, Dickinson and Company, USA), qui a été placé sur un 12 -puits plaque de culture, et la cinétique de dissolution ou le comportement de libération a été évalué à l'aide de ce système. Pour la cinétique de dissolution, 100 µl d'un échafaudage PEG marqué partiellement avec une fluorescence rouge à l'extrémité de la molécule PEG ont été préparés sur l'insert et incubés à 25 °C pendant 24 h. Ensuite, 1000 et 2500 µl de DPBS ont été ajoutés à l'insert et à la plaque à puits, respectivement. A température ambiante dans l'obscurité, un échantillon de 2500 µl de la plaque à puits a été collecté pour évaluer la concentration des substances imprégnées à chaque instant. Après avoir échantillonné la solution, un volume similaire de DPBS frais a été ajouté à la plaque à puits pour maintenir le volume. La concentration des échantillons imprégnés a été déterminée en mesurant l'intensité de fluorescence (λex = 580 nm, λem = 590 nm) à l'aide d'un lecteur de microplaques. Le taux de dissolution a été évalué en pourcentage par rapport à la quantité totale de tétra-PEG marqué avec une fluorescence rouge.

Pour étudier le comportement de libération d'un virus modèle, une solution de nanoparticules de silice (1 mg ml-1, sicastar®-green F, diamètre de 30 nm, Micromod Partikeltechnologies, Allemagne) a été mise en suspension dans chaque solution précurseur de tétra-PEG-GDL pour PEG slime et tétra-PEG-PA pour PEG hydrogel ou éponge à une concentration de 0,1 mg ml-1 et CPEG = 60 g l-1. La solution mixte a été ajoutée aux précurseurs de PEG pour préparer des supports de PEG contenant des nanoparticules. Le comportement de libération des nanoparticules a été évalué selon la méthode décrite pour la dissolution des porteurs de PEG, à l'exception de la mesure de l'intensité de fluorescence (λex = 460 nm, λem = 480 nm).

Le test de relaxation des contraintes pour l'éponge PEG a été réalisé à l'aide de l'appareil de compression Rheogel-E4000 (UBM, Japon) pour les échantillons cylindriques (diamètre : 15 mm, hauteur : 7 mm) à 25 °C. Après l'imposition d'une petite déformation (ε = 0,5), la décroissance de la contrainte a été observée en fonction du temps. La relaxation du module de Young [E(t)] a été calculée comme la contrainte divisée par la déformation appliquée. Pour l'hydrogel PEG et la boue PEG, les mesures viscoélastiques dynamiques ont été effectuées à l'aide d'un rhéomètre à contrainte contrôlée (MCR301; Anton Paar, Graz, Autriche) avec un montage à plaques parallèles d'un diamètre de 25 mm. La dépendance en fréquence angulaire (0,1–100 rad s−1) des modules de stockage (G′) et de perte (G′′) a été mesurée à 25 °C. Les amplitudes de déformation de cisaillement oscillatoire ont été confirmées dans la plage de la viscoélasticité linéaire pour tous les essais. Nous avons converti les données G′ et G′′ en E(t), en supposant la déformation isovolumétrique (E = 3G).

Pour générer les AAV, les plasmides AAVDJ, pAAV-GFPNLS, pAAV-mCherryNLS, pAAV-DNP63A et pAD5 ont été préparés et transfectés sur le sous-confluent cultivé 293AAV, en utilisant la méthode au chlorure de césium10. Le plasmide GFPNLS et mCherryNLS contenait la séquence des signaux de localisation nucléaire (NLS) et la séquence de l'élément régulateur post-transcriptionnel de l'hépatite de la marmotte. Le nombre de copies de gènes a été quantifié par qPCR. Les séquences d'amorce qui ont été utilisées étaient les suivantes : AAV-ITR (Fw : GGAACCCCTAGTAGTGATGGAGTT ; Rv : CGGCCTCAGTGAGCGA).

Le virus AAV a été dilué dans du PBS pour faire 5 × 1010 copies de gène (GC) dans 5 µl. Environ 5 µl de solution AAV préparée ont été mélangés dans 45 µl de tétra-PEG-GDL pour PEG slime et tétra-PEG-PA pour PEG hydrogel ou éponge à CPEG = 60 g l−1, et la solution mélangée a été ajoutée à 50 µl de 60 g l-1 précurseurs de PEG pour préparer des supports PEG contenant AAV pour obtenir CPEG = 60 g l-1. Étant donné que la boue PEG durcit immédiatement après le mélange, la boue a été formée en granules de particules avec une base de 1 × 1 cm et une taille correspondant à la base de l'ulcère. Pour un contrôle, 5 ul de PBS contenant 5 x 1010 GC de virus AAV ont été mélangés dans 95 ul de PBS.

Des souris C57BL/6 femelles âgées de quatre semaines ont été achetées chez Nippon Bio-Supp (Japon). Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité de recherche animale de l'Université de Tokyo. Les chambres en silicium ont été synthétisées par une imprimante 3D20. En bref, un moule d'une chambre en silicone en forme de capuchon avec une bride de 5 mm de large a été fabriqué à l'aide d'une imprimante 3D, et du silicium a été versé dans la chambre en mélangeant deux liquides. La chambre de silicium synthétisée a été stérilisée par autoclave.

La méthode de fixation était basée sur la méthode que nous avons précédemment rapportée pour un test de reconstruction capillaire d'ulcération cutanée20. La zone inter-scapulaire a été choisie pour le site de fixation de la chambre en raison de la grande stabilité de la fixation de la chambre et de l'efficacité du maintien de la surface de l'ulcère dans le temps. Sous anesthésie générale à l'isoflurane, le site de fixation de la chambre a été soigneusement rasé. Des zones circulaires (1 cm de diamètre) de la peau et du tissu sous-cutané ont été enlevées chirurgicalement sous le panniculus carnosus. La chambre a été insérée et le bord et la peau sus-jacente ont été suturés en 4 positions à l'aide d'Ethilon® 5-0 (Johnson and Johnson, USA).

Les formulations d'hydrogel PEG et d'éponge PEG ont été administrées par goutte directe du composant liquide sur la surface de l'ulcère cutané avant que le liquide ne durcisse, à travers une petite incision pratiquée près du sommet de la chambre en silicone. Après administration du mélange, l'anesthésie par inhalation a été poursuivie en position ventrale pendant 5 min, et l'inhalation de l'anesthésique a été interrompue après confirmation de la guérison à la surface de l'ulcère. Du PBS contenant de l'AAV, le groupe témoin, a également été administré de la même manière, en laissant tomber le liquide directement sur la surface de l'ulcère cutané dans la chambre. La boue PEG a été administrée d'une manière différente des autres matériaux car elle était suffisamment dure pour être saisie directement par une pince. La chambre en silicone a été ouverte aux 3/4 et la boue a été appliquée directement sur la surface de l'ulcère. Après administration, le centre de l'ouverture de la chambre a été suturé avec un seul point de nylon 5-0 pour maintenir un joint étanche pour éviter le dessèchement de la surface de l'ulcère.

Les souris ont été euthanasiées par luxation vertébrale cervicale après anesthésie par inhalation, la chambre a été ouverte et l'arrière de la chambre a été observé immédiatement après le traitement à l'aide d'un stéréomicroscope (Axio Zoom®, Carl Zeiss, USA). Le tissu cutané, y compris la chambre en silicone, a ensuite été soigneusement récolté juste au-dessus de la paroi thoracique, y compris la couche musculaire médiane du dos, fixé pendant la nuit dans du PFA à 4 % et placé pendant la nuit dans du saccharose à 30 %. Les échantillons contenant la surface de l'ulcère fixe ont été intégrés dans un composé à température de coupe optimale (OCT Compound®, Sakura Finetek, JAPON) et des échantillons congelés ont été préparés. Les coupes ont été préparées sous forme de tranches de 12 µm à l'aide d'un cryostat, lavées deux fois avec du PBS, fixées dans un milieu de montage 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Fluoromount-G® avec DAPI, Thermo Fisher Scientific, États-Unis) et observé pour la fluorescence. La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) a été réalisée avec la technique générale10.

À partir des images prises avec un stéréomicroscope en mode Axiozoom Z-stack, la tranche avec la bordure la plus clairement discernable des cellules infectées a été utilisée. Pour chaque échantillon, cinq zones (carrées de 20 µm) avec mise au point ont été sélectionnées au hasard. Le nombre de cellules dans le cadre a été compté visuellement et la valeur moyenne a été calculée. Le nombre approximatif a été calculé en fonction de la surface de la surface de l'ulcère. Trois sections obtenues à partir de trois emplacements généralement uniformément répartis pour chaque échantillon ont été extraites. En utilisant les résultats de la coloration HE des sections adjacentes, le nombre de particules fluorescentes ou de cellules positives a été compté visuellement sous un champ de vision de grossissement × 40, divisé en au-dessus et en dessous du tissu adipeux et des couches musculaires.

Pour analyser les titres d'AAV pour les effets hors cible dans le foie, des échantillons ont été prélevés à partir de six lobes et l'ADN génomique a été extrait à l'aide d'un kit commercial (DNeasy® Blood & Sample Kit, QIAGEN, Allemagne). Le nombre de copies du génome de l'AAV a été mesuré sur 100 ng d'ADN génomique en utilisant la qPCR sur un système de PCR en temps réel StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific, USA). Les amorces ont utilisé la séquence du génome viral spécifiquement pour AAV-ITR (Fw : GGAACCCCTAGTAGTGATGGAGTT ; Rv : CGGCCTCAGTGAGCGA) et le gène de la titine de souris (Fw : CTCCATCACTAGGGGTTCCT ; Rv : TTCAGTCATGCTGCTAGCGC). Le nombre de copies des génomes d'AAV a été exprimé en valeur absolue par noyau diploïde. Tous les échantillons d'ADN génomique ont été analysés en triple.

DNP63A-AAVDJ (1 × 1012 GC) a été marqué à l'aide d'un kit de marquage de protéines disponible dans le commerce (Alexa Fluor® 568 Protein Labeling Kit, Thermo Fisher Scientific, USA) en suivant les instructions du fabricant3.

Des coussinets adipeux sous-cutanés de l'aine ont été prélevés sur des souris euthanasiées âgées de 3 à 5 semaines. Le tissu adipeux a été digéré par voie enzymatique10 et la fraction vasculaire stromale a été isolée par centrifugation, inoculée sur une plaque à 6 puits recouverte de gélatine en utilisant un puits pour chaque spécimen de souris et maintenue dans un milieu de croissance DMEM complet constitué de DMEM (contenant 4,5 g l−1 glucose , 110 mg l−1 de pyruvate de sodium et 4 mM de L-glutamine) additionnée de 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur, solution d'acides aminés non essentiels MEM 1:100 (v/v) (Gibco) , et supplément GlutaMAX 1:100 (v/v) (Gibco).

Les mASC primaires P3 ont été coulées sur une lame de verre posée sur une plaque de culture cellulaire, avec 5 × 104 cellules dans 200 μl de milieu de croissance DMEM complet. Après 1 h d'incubation à 37 °C, le milieu a été ajouté à la plaque jusqu'à la dose habituelle de culture cellulaire. Après 24 h d'incubation, des MOI 2000 (GC par cellules) d'AAV marqués ont été placés sur la plaque. Après 1 h d'incubation à 4 ° C, la cellule attachée à la lamelle couvre-objet a été soigneusement collectée, puis montée avec une coloration DAPI pour être évaluée au microscope confocal.

L'AAV marqué (1 × 1010 GC par souris) et les nanoparticules de silice (dose finale; dilution 20 fois) ont été mélangés dans 100 μl de PBS et administrés à l'ulcère de la souris dans la chambre. Les ulcères ont été prélevés 24 h plus tard pour observation histologique.

Les mASC primaires P3 ont été ensemencées sur une plaque à 24 puits (surface de base 1,9 cm2) avec 1 × 104 cellules dans chaque puits. Après 24 h d'incubation, les cellules ont reçu GFPNLS-AAVDJ. GFPNLS-AAVDJ a été incubé à 37 ° C avec ou sans sérum sanguin de souris (purifié avec un tube de sérum BD Microtainer® avec gel séparateur) pendant une période déterminée (0 à 24 h), puis administré à des mASC. Le milieu de culture a été renouvelé 24 h après l'administration d'AAV. Les cellules GFP-positives ont été comptées 72 h après l'infection dans des puits quadruplés.

Le logiciel Excel (Microsoft, USA) a été utilisé pour évaluer la signification statistique. Pour déterminer la signification entre deux groupes, des tests t de Student bilatéraux non appariés ont été appliqués. p ≤ 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. La distribution des données a été supposée normale. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon, mais nos tailles d'échantillon étaient similaires à celles rapportées dans une publication précédente10. La collecte et l'analyse des données n'ont pas été effectuées à l'aveuglette.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources pour les graphiques et les diagrammes des figures sont disponibles en tant que données supplémentaires et toute information restante peut être obtenue auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les matériaux sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par les numéros de subvention JSPS KAKENHI JP20H03847 (à MK); JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering) (JP20K20609) (à MK); JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (A) (JP21H04688) (à TS); Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (JP20H05733) (à TS); Subventions d'aide aux boursiers JSPS (21J10828) (à MK); Subventions d'aide aux boursiers JSPS (JP20J01344) (à SI); Subventions d'aide aux scientifiques en début de carrière (JP20K15338) (à TK); Agence japonaise pour la science et la technologie (JST) CREST sous le numéro de subvention JPMJCR1992 (à TS); et AMED sous le numéro de subvention JP21zf0127002 (à MO, TS et MK). Victoria Muir, PhD, d'Edanz (https://jp.edanz.com/ac) a édité une ébauche de ce manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Motoi Kato, Shohei Ishikawa.

Département de chirurgie plastique et reconstructive, École supérieure de médecine, Université de Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japon

Motoi Kato, Qi Shen, Zening Du, Takao Numahata, Mutsumi Okazaki et Masakazu Kurita

Département de bioingénierie, École d'ingénierie, Université de Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japon

Shohei Ishikawa, Takuya Katashima et Takamasa Sakai

Centre de biologie des maladies et de médecine intégrative, École supérieure de médecine, Université de Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japon

Mitsuru Naïto

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TS et M. Kurita ont conçu l'étude. M. Kato et SI ont conçu les expériences. L'acquisition et/ou l'analyse des données a été effectuée par M. Kato, les AAV SI, TK et TN ont été créés par QS, ZD, TN et M. Kurita. Les polymères ont été synthétisés par TK et MNM Kato, SI, TK, TS et M. Kurita ont rédigé le manuscrit. Les tâches administratives, techniques ou de supervision étaient assurées par MO, TS et M. Kurita.

Correspondance à Takamasa Sakai ou Masakazu Kurita.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Dan Wang, Navneet Matharu et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs principaux de la manipulation : Huan Bao, Eve Rogers et Anam Akhtar. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Kato, M., Ishikawa, S., Shen, Q. et al. Support de poly(éthylène glycol) réticulé dynamique et formable in situ pour une infection virale adéno-associée localisée et des effets hors cible réduits. Commun Biol 6, 508 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04851-w

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Reçu : 14 juin 2022

Accepté : 19 avril 2023

Publié: 16 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04851-w

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