Lumière 3D efficace

Communications Biology volume 6, Article number: 170 (2023) Citer cet article

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La possibilité d'imager des échantillons de tissus humains en 3D, avec une résolution cellulaire et un large champ de vision (FOV), peut améliorer les investigations fondamentales et cliniques. Ici, nous démontrons la faisabilité de l'imagerie par feuille de lumière d'environ 5 cm3 de cerveau humain fixé au formol et jusqu'à environ 7 cm3 d'échantillons de cancer de la prostate fixés au formol fixés en paraffine (FFPE), traités avec le protocole FFPE-MASH. Nous présentons un prototype de microscopie à feuille de lumière, le microscope à illumination plane sélective à double vue des tissus dégagés (ct-dSPIM), capable d'acquisitions rapides 3D à haute résolution de tissus dégagés à l'échelle cm3. Nous avons utilisé des scans en mosaïque pour obtenir des aperçus 3D rapides d'échantillons de tissus entiers ou des aperçus à plus haute résolution de grandes ROI à différentes vitesses : (a) Mosaic 16 (résolution isotrope de 16,4 µm, ~ 1,7 h/cm3), (b) Mosaic 4 (isotrope de 4,1 µm résolution, ~ 5 h/cm3) et (c) Mosaic 0,5 (0,5 µm près de la résolution isotrope, ~ 15,8 h/cm3). Nous avons pu visualiser les couches corticales et les neurones autour de la frontière des zones du cerveau humain V1 et V2, et nous avons pu démontrer une qualité d'imagerie appropriée pour la notation du score de Gleason dans des échantillons épais de cancer de la prostate. Nous montrons que l'imagerie ct-dSPIM est une excellente technique pour évaluer quantitativement l'ensemble des échantillons de tissus humains à grande échelle préparés par MASH en 3D, avec un potentiel clinique futur considérable.

Malgré les avantages évidents des visualisations de microstructures à grande échelle, les échantillons de tissus dans la recherche fondamentale et la pathologie clinique sont encore principalement examinés avec des microscopes optiques conventionnels dans des coupes de tissus minces comme du papier (allant d'environ 5 à 100 µm), montées sur des lames de verre. Cela détruit la structure de l'organe 3D et ne fournit que des informations 2D limitées sur un petit champ de vision (FoV). Par conséquent, des avancées significatives sont nécessaires vers de nouvelles approches de microscopie multi-échelles 3D à grande vitesse et à volume élevé avec une résolution suffisante. Cela permettra la détection de détails cruciaux et de caractéristiques d'aperçu dans l'ensemble des grands échantillons de tissus (allant de mm à cm).

La structure 3D complexe du cerveau humain est intrinsèquement multi-échelle et se compose de très petites structures qui s'étendent sur de grandes distances, voire sur des zones cérébrales entières1. La cytoarchitecture corticale en couches, par exemple, est définie par la densité, la taille et la morphologie cellulaires à l'échelle microscopique, mais ses couches s'étendent sur des zones corticales entières et, par conséquent, la stratification se produit sur des échelles centimétriques. Pour permettre une caractérisation quantitative, telle que le comptage des cellules, dans différentes couches et même dans des zones cérébrales entières, il est nécessaire d'effectuer à la fois de grands balayages d'aperçu FoV, ainsi qu'une imagerie cellulaire à haute résolution. Ce type de données est essentiel, par exemple, pour une modélisation neuronale biologiquement informée réaliste2. Par conséquent, l'étude de la cytoarchitecture en couches nécessite à la fois une imagerie à haute résolution et de grands FoV.

Dans le cancer de la prostate, les tumeurs sont caractérisées par une multi-focalité et une morphologie hétérogène avec divers motifs histo-morphologiques en 3D, sur des volumes étendus3,4. À ce jour, un diagnostic définitif de cancer de la prostate nécessite une vérification histo-pathologique des biopsies basée sur le score de Gleason3. Ceci est difficile, comme le montre la variabilité inter-observateur, qui à son tour peut conduire à un sous-traitement ou à un sur-traitement des patients4. De plus, les critères de "surveillance active" sont déterminés par la quantification de l'étendue de la tumeur et le grade de Gleason5. Étant donné que les coupes en série complètes des noyaux de biopsie de la prostate sont rarement effectuées, un sous-classement peut survenir dans les cas avec plusieurs petits foyers d'adénocarcinome de la prostate, car ils sont présents à différents niveaux dans les blocs de paraffine5. De plus, des biopsies faussement négatives peuvent survenir à la suite de la section incomplète de blocs de tissus. Par exemple, Paulk et al. démontrer la présence du carcinome de la prostate dans les sections plus profondes des blocs de paraffine qui était absent sur les sections initiales H&E5. Dans la pratique actuelle, couper systématiquement l'ensemble des blocs de paraffine pour augmenter la visualisation des tissus peut ne pas être possible en raison de la charge de travail plus élevée et du prix plus élevé, par rapport à la procédure standard de sectionnement de seulement 3 à 4 niveaux.

Au cours des dernières années, la microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM), ainsi que la compensation optique des tissus, ont été utilisées pour la visualisation 3D et l'examen des tissus de rongeurs et humains à une résolution mésoéchelle à microéchelle6,7,8,9,10,11. Divers laboratoires ont développé des protocoles de compensation optique, tels que CLARITY6,8, iDISCO9,10 et CUBIC12, qui ont principalement été appliqués pour rendre le cerveau de souris transparent, afin de comprendre à la fois la structure et la pathologie du cerveau7. Cependant, l'application de l'imagerie par feuille de lumière des tissus nettoyés à de grands échantillons de cerveau humain adulte archivés (c'est-à-dire fixés avec des fixateurs d'aldéhyde), en particulier, a été un défi majeur en raison de la taille de l'échantillon et des difficultés d'application de la compensation, de l'étiquetage et de l'imagerie. dans de grands volumes de tissus riches en myéline13.

Des travaux antérieurs ont démontré le succès de la compensation, de l'étiquetage et de l'imagerie LSFM du cerveau humain7,12,13,14,15,16 et des biopsies du cancer de la prostate humaine17. Cependant, bien que des échantillons de cerveau humain entre 1 mm313 et 1 cm312 et des dalles de tissu de 1,5 cm d'épaisseur14 aient été nettoyés et étiquetés avec succès, la taille réelle de l'échantillon imagé LSFM a été limitée à 1 mm3 15 ou 500 µm d'épaisseur de dalles de tissu13 avec un volume maximum rapporté de ~ 10,5 mm × 14,1 mm × 3 mm16. Zhao et al. imagé le plus grand échantillon de cerveau humain optiquement effacé et étiqueté à ce jour (7,5 × 5 × 0,4 cm) avec une microscopie confocale. Cependant, une configuration de microscopie à feuille de lumière augmenterait considérablement la vitesse et l'évolutivité de l'acquisition d'images. Des études récentes sur la prostate, telles que décrites et réalisées par Glaser et al.17. se concentrait principalement sur les biopsies à l'aiguille centrale de 1 à 2,5 mm. Un aperçu des configurations LSFM les plus importantes appliquées aux échantillons de cerveau humain et de cancer de la prostate (et à d'autres types d'échantillons) est répertorié dans le tableau 1, y compris le volume et la résolution de l'échantillon. Le laboratoire Liu17, ainsi que le laboratoire Shroff18, ont monté des objectifs à immersion multiple pour l'imagerie des tissus dégagés sur leur LSFM à toit ouvert et la double microscopie à illumination plane sélective inversée (diSPIM) respectivement, pour permettre l'imagerie des tissus dégagés, par exemple, échantillons de prostate humaine et de cerveau de souris. Bien que cela montre que la technologie LSFM et les protocoles de compensation évoluent rapidement, l'imagerie 3D rapide des tissus dégagés d'échantillons de prostate et de cerveau humain à grande échelle de plusieurs centimètres de taille latérale et de plusieurs cm3 de volume est jusqu'à présent restée hors de portée.

Nous démontrons dans ce travail que nous nettoyons optiquement, étiquetons et imaginons plusieurs centimètres cubes d'échantillons de tissus du cerveau humain et du cancer de la prostate (sections axiales entières). Auparavant, nous avons présenté MASH (Multiscale Architectonic Staining of Human cortex), une approche évolutive de compensation et d'étiquetage qui s'est avérée efficace pour des dalles jusqu'à 5 mm d'épaisseur de tissu cérébral humain adulte d'archives. Ici, nous avons traité des échantillons de cerveau humain avec une compensation et un étiquetage MASH. De plus, nous introduisons FFPE-MASH et pour la première fois traitons avec succès des échantillons de prostate humaine FFPE. Nous introduisons ensuite le microscope à éclairage plan sélectif à double vue des tissus clairs (ct-dSPIM) pour effectuer une imagerie 3D LSFM efficace de grands tissus clairs, qui dépasse de loin les études d'échantillons de cerveau et de prostate humains clairs LSFM existants en volume imagé.

Notre nouvelle approche permet l'imagerie 3D, la visualisation et la quantification de grands volumes à haute vitesse et un compromis vitesse-résolution réglable. Pour montrer la faisabilité de cette méthode, nous décrivons l'imagerie LSFM du cerveau humain et de la prostate. Nous utilisons le ct-dSPIM pour imager le cerveau humain (lobe occipital) jusqu'à ~ 50 × 35 × 3 mm (> 5 cm3) et des échantillons de résections de cancer de la prostate humaine (la section axiale entière après prostatectomie) jusqu'à ~ 40 × 35 × 5 mm (~7 cm3). L'imagerie ct-dSPIM permet d'étendre les méthodes et études actuelles et permet l'examen de coupes axiales de la prostate entières de plusieurs mm d'épaisseur. L'application de l'imagerie ct-dSPIM à de plus grands échantillons de cancer de la prostate permet de nouvelles informations 3D sur la morphologie des tissus bénins et néoplasiques. Ces connaissances 3D supplémentaires sur les tumeurs peuvent améliorer la visualisation des tissus tout au long du bloc, conduire à une meilleure compréhension de l'architecture de l'adénocarcinome de la prostate et pourraient éventuellement améliorer le diagnostic du cancer de la prostate.

Nous avons réalisé une imagerie 3D multi-échelles sur le cerveau humain préparé par MASH (Figs. 1 à 5) et les coupes axiales de la prostate entière (Figs. 6, 7; Figs. Supplémentaires 1, 2) avec un grand FoV avec Mosaic 4 et Mosaic 16 acquisitions et un FoV modéré et haute résolution pour une région d'intérêts spécifique. La mosaïque 16 d'échantillons de cerveau humain (Figs. 1, 2, 4) a permis des balayages d'ensemble à vitesse relativement élevée (environ 8 à 16 h, ~ 1,7 cm3/h, 16,4 µm isotrope, tableau 2) d'un bloc de tissu entier à 5 cm × 3 cm de dimension latérale et 3 mm d'épaisseur. Les plus petites ROI des échantillons de cerveau humain ont été imagées avec un Mosaic 4 (Figs. 3, 4). et Mosaïque 0.5. (Fig. 5). Nous présentons et discutons tour à tour ces résultats.

a Échantillon prélevé env. 6 mm en avant du pôle occipital (troisième section de 3 mm d'épaisseur dans la direction postérieure à antérieure). De gauche à droite : échantillon fixé au formol, non coloré et échantillon coloré au MASH-NR des faces postérieure et antérieure ; échantillon nettoyé imagé du côté postérieur (la forme montre les caractéristiques de l'échantillon transparent à la fois sur le côté antérieur et postérieur ; grille : plus petits carrés 1 × 1 mm, carrés gras 10 × 10 mm). Reconstruction 3D de la tranche entière à une résolution isotrope de 16,4 µm avec une acquisition Mosaic 16 (barre d'échelle : 1 cm) : Les couches riches en cellules densément colorées sont reconnaissables même à faible grossissement/grands aperçus FOV (têtes de flèches blanches). La frontière V1/V2 est indiquée par les flèches noires dans la vue d'ensemble et le retour sur investissement agrandi. b Coupe antérieure consécutive du même lobe occipital env. 9 mm en avant du pôle occipital, panneaux comme décrit pour (a).

Rendu 3D et plans orthogonaux de données isotropes à 16,4 µm. Vues orthogonales de 50 µm MIP (XY : vert, XZ : rouge, YZ : bleu) de l'ensemble de l'échantillon de 3 mm d'épaisseur. Barres d'échelle : 5 mm pour le rendu XZ, YZ et volume respectivement et 2,5 mm pour le plan XY.

Rendu 3D d'une acquisition Mosaic 4 d'une ROI au voisinage du cortex visuel primaire humain (en haut à gauche). Des vues orthogonales de MIP de 50 µm (XY : bleu, XZ : vert, YZ : rouge) montrent des couches corticales indépendantes de l'orientation (flèches blanches). Les bords dentelés dans la vue XZ résultent du redressement lorsque le bord de l'acquisition se trouve à l'intérieur du tissu. Les retours sur investissement agrandis du MIP (XY : jaune, XZ : magenta, YZ : cyan) démontrent qualitativement la résolution échantillonnée isotropiquement et la qualité de l'image et de l'étiquetage au plus profond de l'échantillon. Barres d'échelle : rendu de volume, plan XY et YZ 3 mm ; XZ : 1,5 mm ; ROI agrandies de 0,5 mm, respectivement.

Données acquises à partir de la tranche entière du lobe occipital (troisième section de 3 mm d'épaisseur du pôle occipital vers la direction antérieure) présentées à une résolution de 16,4 µm (volume de 16,4 µm ; côté gauche). Deux gyri ont été imagés à une résolution de 4,1 µm (bleu) et dans le volume de 0,5 µm (rouge) à une résolution anisotrope, avec une taille de pixel de 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm. Les inserts agrandis démontrent la résolution efficace réalisable avec le volume de 4,1 µm (magenta) et le volume de 0,5 µm (orange), respectivement. Alors que le volume de 4,1 µm montre des structures mésoscopiques indicatives de minicolonnes (surlignées en magenta), il peut être difficile de différencier les petites cellules individuelles des grappes de cellules à cette résolution dans le cortex visuel koniocellulaire extrêmement densément peuplé. Le volume de 0,5 m permet l'identification des cellules individuelles, y compris les parties proximales des dendrites apicales et basales (flèches blanches). Barres d'échelle : 5 mm (volume de 16,4 µm), 3 mm (volume de 4,1 µm) et 0,25 mm (volume de 4,1 µm, panneau agrandi), 1 mm (volume de 0,5 µm) et 0,075 mm (volume de 0,5 µm, panneau agrandi).

un rendu volumique du jeu de données utilisé pour le comptage des cellules. b Résultats de la segmentation manuelle des couches pour l'ensemble du volume. Les couleurs sont les suivantes : Couche I cyan, Couche II rouge vif, Couche IIIa orange, Couche IIIb vert, Couche IV magenta, Couche V bleu, Couche VI rouge foncé et matière blanche en jaune. Le tissu dans la partie non segmentée du volume a été endommagé et n'a pas permis la segmentation des couches et a été exclu de l'analyse. Plan unique (plan XY du volume d'image découpé) des données filtrées (c) et des objets automatiquement segmentés (d). Les cellules segmentées sont affichées dans des couleurs aléatoires. e Estimations de la densité cellulaire dérivées du nombre total de toutes les cellules segmentées par segment de couche sur tout le volume de l'image (pour plusieurs segments non connectés des mêmes couches, les nombres ont été regroupés). Couleurs comme indiqué pour (b). Les barres d'échelle pour toutes les images du côté le plus à gauche sont de 500 µm et pour les deux panneaux agrandis de 75 µm.

Les échantillons sont présentés à différentes étapes du pipeline de traitement sur le côté gauche : après déparaffinage et blanchiment (a, e), après coloration (b, f) et après correspondance RI (c'est-à-dire, effacé, c, g). Sur le côté droit, un MIPs du jeu de données Mosaic 16 sur env. 50 µm sont représentés en niveaux de gris inversés (d, h). Les cercles rouges indiquent les régions cancéreuses (identifiées par un pathologiste). Abréviations : stroma fibromusculaire antérieur AFS, zone centrale CZ, urètre U (prostatique), zone périphérique PZ, zone de transition TZ. Barres d'échelle : 3 mm.

L'échantillon de la Fig. 8e – h, est montré ici en 2D (a, une couche sur toute la surface en yz montrée dans la boîte rouge, y compris 2 sections orthogonales sur toute l'épaisseur de l'échantillon en vert (xz) et bleu (xy ). Les cases en pointillés indiquent la tumeur (telle qu'identifiée par le pathologiste). La région tumorale de cet échantillon (boîte rouge en pointillés en a) est également indiquée en b sous forme de rendu de volume 3D. Barre d'échelle : a, 3 mm ; b, un carré de la grille rouge 1 mm.

Des tranches épaisses de lobe occipital de cerveau humain (Fig. 1) ont été prélevées env. 6 mm en avant du pôle occipital (troisième section de 3 mm d'épaisseur dans la direction postérieure à antérieure; voir Fig. 1a et vidéo supplémentaire 1) et la tranche antérieure consécutive (~ 9 mm en avant du pôle) du même lobe occipital (Fig. 1b et vidéo supplémentaire 2). Les décolorations sombres dans les tranches non traitées (panneaux les plus à gauche) résultaient probablement de l'accumulation post-mortem de sang dans les vaisseaux à l'arrière de la tête. Les tranches colorées montrent la bande de Gennari en V1 (Fig. 1, indiquée par des flèches). La morphologie de l'échantillon nettoyé par MASH est bien conservée après la déshydratation, la délipidation et l'appariement de l'indice de réfraction (RI), et la matière grise ainsi que la matière blanche deviennent hautement transparentes. Le rétrécissement des tissus observé dans les échantillons effacés par MASH est relativement mineur, avec une réduction moyenne de la surface mesurée de 12 % (suppl. Figure 3). Les artefacts noirs de la figure 1a proviennent de la diffusion de la lumière lors de l'imagerie de la colle chaude utilisée pour fixer l'échantillon dans la chambre d'imagerie imprimée en 3D. Cela se produit lorsque la couche enregistrée la plus profonde du volume d'image s'étend sur le tissu et dans la colle en dessous.

Nous avons utilisé les échantillons de lobe occipital illustrés à la Fig. 1 pour l'imagerie ct-dSPIM multi-échelles. Tout d'abord, nous avons effectué un aperçu de l'analyse Mosaic 16 de l'échantillon complet (voir les figures 1, 2, 4 et la vidéo supplémentaire 3). La figure 1 montre la reconstruction 3D des deux tranches avec un volume de données Mosaic 16 à une résolution isotrope de 16,4 µm. La direction de numérisation peut être reconnue comme la direction des longues piles ou bandes d'imagerie (chacune de 0,74 × 0,74 mm de profondeur et de largeur et de plusieurs centimètres de long), qui sont carrelées dans les deux directions restantes pour fournir une couverture complète de l'échantillon 3D. Plusieurs couches corticales peuvent être distinguées par leurs différences de densité cellulaire (Fig. 1, têtes de flèches blanches) et la bordure V1/V2 est visible à cette résolution mésoscopique comme un changement clair dans la structure des couches (Fig. 1, flèches noires).

Sur la figure 2, des rendus volumiques et des projections orthogonales d'intensité maximale (MIP) sont présentés pour mieux visualiser la couverture volumique obtenue. Les différents axes (tels qu'étiquetés dans la visionneuse d'images, voir Fig. 4 supplémentaire) sont indiqués respectivement en vert (XZ), rouge (YZ) et bleu (XY). La vue XY montre le pavage des longues piles d'acquisition dans la direction Z du volume (correspondant à l'axe X de la platine lors de l'acquisition). Les vues orthogonales mettent également en évidence la pénétration et la qualité de l'étiquette dans tout l'échantillon de 3 mm d'épaisseur.

Après avoir acquis la vue d'ensemble Mosaic 16, un balayage Mosaic 4 à résolution isotrope de 4,1 µm à plus haute résolution a été effectué dans une ROI proche de la frontière V1/V2 (Figs. 3, 4). Les vues orthogonales des MIP de 50 µm sont indiquées respectivement par des panneaux verts (XY), rouges (XZ) et bleus (YZ) et montrent des différences de stratification corticale indépendantes de l'orientation (Fig. 3, flèches). Les encarts de grossissement plus élevé (XY : jaune, XZ : magenta, YZ : cyan) sont un retour sur investissement du MIP et démontrent qualitativement une résolution quasi isotrope (échantillonnée de manière isotrope à 4,1 μm, mais anisotrope optiquement en raison d'une feuille de lumière d'environ 8 μm d'épaisseur) et élevée qualité d'image et d'étiquetage même au plus profond de l'échantillon (Fig. 3). Les caractéristiques corticales mésoarchitectoniques telles que les minicolonnes deviennent bien visibles à cette résolution (Fig. 4 panneau magenta) et des couches corticales plus fines, qui ne sont pas visibles dans les données Mosaic 16, peuvent être distinguées. La résolution plus élevée permet même de distinguer certaines des plus grandes cellules individuelles (Figs. 3, 4, panneaux agrandis), malgré la granularité du cortex occipital.

Pour démontrer le potentiel de l'imagerie cérébrale volumétrique pour l'histologie 3D quantitative, nous avons effectué un comptage cellulaire automatisé dans un volume haute résolution de 0, 5 µm (supplémentaire. Vidéo 4) (Fig. 5; taille de voxel: 0, 725 µm × 0, 5127 µm × 0, 5127 µm). L'objectif était de comparer quantitativement les densités cellulaires à travers les différentes couches corticales. Le volume entier (Fig. 5a) d'un ensemble de données redressé, cousu et retranché a été segmenté manuellement dans les différentes couches corticales (Fig. 5b). La segmentation des couches n'a pas pu être effectuée de manière satisfaisante dans une région de l'ensemble de données, qui contenait des tissus endommagés. Cette région a donc été exclue de l'analyse (parties non colorées sur la Fig. 5b). Par la suite, les données ont été traitées dans un pipeline automatisé pour filtrer les images brutes et segmenter les corps cellulaires (Fig. 5c, d). Le nombre de tous les segments cellulaires, supérieurs à 125 µm3 et entièrement contenus dans le segment de couche correspondant, a été utilisé pour dériver des estimations de densité cellulaire pour chaque couche (Fig. 5e). Les comptages de cellules ont été regroupés pour les couches avec plusieurs segments non connectés. Comme prévu, la couche I montre la densité cellulaire la plus faible avec un peu plus de 60 000 objets segmentés par mm3, bien que la densité soit plus élevée que prévu pour cette couche. La couche II, tout en montrant des densités cellulaires plus élevées que la couche I ou IIIa (comme prévu), montre une densité inférieure à celle attendue de l'impression qualitative lors de la segmentation des couches. Étonnamment, les couches IIIb, V et VI avaient des densités cellulaires plus élevées que les couches II ou IIIa. La couche IV, qui est visiblement de loin la couche la plus dense, présentait également la densité cellulaire la plus élevée de notre ensemble de données, avec près de 100 000 objets segmentés par mm3. Plusieurs de ces observations s'expliquent probablement au moins en partie par des effets de volume partiels. Pour valider les résultats de la segmentation automatisée, nous avons effectué un comptage manuel des cellules sur le même ensemble de données. La méthode de segmentation cellulaire automatique employée a donné un surcomptage moyen de 36 %, par rapport aux comptages manuels (voir Fig. 5 supplémentaire). Cela a été partiellement, mais pas entièrement atténué par l'exclusion des segments considérés comme trop petits pour représenter les cellules (<125 µm3). Après filtrage de ces petites structures, les seconds résultats automatisés surcomptaient en moyenne de 17%. Il a été observé que les cellules particulièrement grandes dans la segmentation automatique étaient souvent segmentées en plusieurs objets plus petits lorsqu'il y avait des différences d'intensité visibles à travers le cytoplasme ou entre le noyau des cytoplasmes et le nucléole.

Nous avons développé FFPE-MASH pour les coupes axiales de prostate humaine fixées au formol et incluses en paraffine (FFPE). Pour la première fois, le protocole MASH avec l'étiquette MASH-NR a été appliqué avec succès à de grands échantillons de cancer de la prostate provenant de différents patients (les coupes axiales entières ; Figs. 6, 7 ; Figs. 1, 2 supplémentaires ; Vidéo supplémentaire 5) . Nous démontrons donc la faisabilité de l'application de MASH non seulement à des tissus d'organes humains autres que le cerveau, mais également à du matériel FFPE. De plus, nous avons pu montrer la faisabilité de l'imagerie Mosaic 16 ct-dSPIM à grande vitesse (1,7 h / 1 cm3) sur de grands échantillons de cancer de la prostate effacés et marqués par MASH-NR. Les grands aperçus mésoscopiques permettent la description anatomique de la morphologie du tissu prostatique et l'indication d'éventuelles régions néoplasiques (Fig. 6d, h ; indiquées par des cercles rouges), qui ont été confirmées comme étant un adénocarcinome de la prostate par histopathologie. L'examen microscopique des coupes correspondantes à l'hématoxyline-éosine a montré que la tumeur était constituée de glandes néoplasiques cribriformes et fusionnées, compatibles avec un adénocarcinome prostatique de haut grade. Différentes zones et compartiments de la prostate ont pu être classés dans le volume Mosaic 16 (Fig. 6d, h), à savoir le stroma fibromusculaire (AFS), la zone centrale (CZ), la zone périphérique (PZ), la transition zone (TZ) et l'urètre (U). De plus, des scans Mosaic 4 à plus haute résolution ont permis de détecter la morphologie de la tumeur dans tout l'échantillon de tissu et le pathologiste a suggéré un score de Gleason de 3 et 4 dans la section axiale entière (prostatectomie) (Fig. 2 supplémentaire).

La visualisation 3D du ct-dSPIM imagé les coupes axiales de la prostate entière (Fig. 7; Fig. 2 supplémentaire) permet la détection de la coupe transversale de l'urètre prostatique, illustrée dans les coupes orthogonales sur toute l'épaisseur de l'échantillon (Fig. 7a, encadré vert et bleu, l'insert en pointillé indique la région tumorale). Le volume 3D illustré à la Fig. 7 montre également la région cancéreuse, indiquée par la ligne pointillée rouge en a dans la vue de surface, comme confirmé par un pathologiste. Les régions tumorales sont également indiquées dans la section orthogonale de la figure 7a dans la ligne pointillée verte et bleue. La figure 7b montre un grossissement 3D supérieur de la région tumorale illustrée dans la case en pointillés rouges en a.

Nous présentons ici le nouveau prototype ct-dSPIM pour l'imagerie de la feuille de lumière des tissus dégagés d'échantillons de tissus humains à grande échelle et notre application aux sections axiales du cerveau humain et de la prostate (après prostatectomie). Nous avons pu démontrer l'efficacité et la faisabilité de l'imagerie ct-dSPIM avec à la fois des résections de lobe occipital humain archivées préparées par MASH19 (Figs. 1–5) et des résections de la prostate (prostatectomie ; Figs. 6, 7). Le protocole FFPE-MASH19 avec le marquage MASH-NR a été appliqué avec succès pour la première fois à de grands échantillons de cancer de la prostate fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), comme le montrent les Fig. 6 et 7, ainsi que dans les Figs supplémentaires. 1 et 2 et film supplémentaire 5. Cela montre non seulement l'applicabilité de MASH à d'autres types de tissus en plus du cerveau humain, mais, tout aussi important, aux échantillons FFPE en plus des échantillons fixés au formol. Auparavant, nous appliquions le protocole MASH à des échantillons de cerveau humain d'archives fixés au formol qui étaient conservés dans du PFA à 4 % jusqu'à leur utilisation. L'utilisation du protocole MASH sur le matériel FFPE pourrait accroître son application dans d'autres domaines, puisque le tissu FFPE est couramment utilisé dans la recherche et l'application clinique depuis des décennies, ce qui signifie que l'effet potentiel sur la pratique clinique est considérable. L'étape la plus importante dans la modification du MASH vers le tissu FFPE est la déparaffinisation initiale dans le xylène, qui doit être suffisamment longue pour permettre la dissolution complète de la paraffine dans des échantillons épais. Ainsi, cette étape pourrait être omise par l'application de cette technique sur des échantillons frais, sans fixations préalables et traitement avec paraffine, ce qui accélérerait considérablement le temps de traitement des tissus MASH.

En complément des acquisitions Mosaic 16 avec une résolution isotrope de 16,4 µm, nous avons acquis des résolutions plus élevées dans des régions d'intérêt spécifiques. Alors qu'un Mosaic 16 fournit une vue d'ensemble du bloc de tissu, Mosaic 4 (résolution isotrope de 4,1 µm) et Mosaic 0,5 (résolution proche de 1 µm) permettent une évaluation plus détaillée de parties du même tissu. Ensemble, ce schéma d'acquisition de données multi-échelles permet l'identification de différentes caractéristiques mésoscopiques, telles que les couches, les minicolonnes et les corps cellulaires dans le cerveau (Fig. 4). Cela permet l'analyse complète et détaillée de grands échantillons de tissus humains.

L'échantillonnage isotrope des ensembles de données Mosaic 16 et Mosaic 4 est basé sur une relation √2 de la longueur du pas de coupe à la résolution d'échantillonnage latéral et est optiquement limité par la résolution axiale, c'est-à-dire par l'épaisseur théorique de la feuille de lumière d'environ 8 µm. La vitesse d'acquisition globale des scans Mosaic n'est limitée que par la vitesse de balayage maximale de l'étage et varie actuellement de 1,7 h/~1 cm3 pour Mosaic 16 à 5 h/~1 cm3 pour Mosaic 4 et 15,8 h/~1 cm3 pour Mosaic 0,5 . Les scans de vue d'ensemble Mosaic 16 ont permis une visualisation à haut volume et à grande vitesse de l'ensemble d'une dalle de tissu de prostatectomie de 5 mm ou d'une dalle de tissu de lobe occipital humain entier de 3 mm. Ici, nous montrons des scans Mosaic des échantillons occipitaux avec une durée d'acquisition comprise entre 2 h 23 min (Mosaic 0.5), 3 h 45 min (Mosaic 4) et jusqu'à 8 h 26 min de l'ensemble de l'échantillon occlobe de 5 cm3 (Mosaic 16 ; 1 à 5). Le temps nécessaire pour acquérir une couche de surface Mosaic 16 scan d'un échantillon de prostate, comme illustré à la Fig. 6, était de 50 min.

À l'avenir, la méthode pourrait repousser les limites actuelles de résolution. Il est théoriquement possible d'effectuer une imagerie ct-dSPIM à double vue à résolution optique efficace d'environ 1 µm, qui a principalement été démontrée dans des cultures cellulaires. Très récemment, des démonstrations dans des tissus nettoyés ont vu le jour18,20 en appliquant l'imagerie à double vue et le traitement de déconvolution à double vue ultérieur grâce à de fortes accélérations du traitement de déconvolution. Cependant, même dans les développements les plus récents20, où la déconvolution est mise en œuvre via un apprentissage approfondi informé par le processus de formation d'image, les temps de traitement sont encore de l'ordre de quelques heures (2 à 3 h) pour des volumes trois ordres de grandeur plus petits (1,4 × 2,3 × 0,5 mm3) que celles rapportées ici, ce qui implique des milliers d'heures de traitement pour les très grands échantillons présentés ici même avec les méthodes actuelles les plus avancées. De plus, les acquisitions à double vue doubleraient les temps d'acquisition actuels, ce qui rendrait le coût total de l'amélioration de la résolution considérable et irréaliste dans le contexte pertinent de très grands échantillons de tissus et d'applications cliniques futures dans la prostate. De plus, aux fins de cette étude, dans le but d'obtenir une imagerie à grand FoV efficace et évolutive à une résolution suffisante (plutôt que la résolution optiquement limitée la plus élevée possible), l'analyse coût/bénéfice et la faisabilité en termes de temps total rendent actuellement l'imagerie à double vue défavorable. Dans notre étude actuelle, nous avons inclus des données d'imagerie en mosaïque ct-dSPIM d'un sous-volume de cerveau humain (lobe occipital) avec une résolution (échantillonnée) de 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm. Bien que la véritable résolution optique soit inférieure (de l'ordre de 8,0 µm × 0,8 µm × 0,8 µm avec l'objectif 0,4 NA), ces données à vue unique peuvent être acquises à des débits de données raisonnables et sont suffisantes pour les fins prévues, y compris la détection de cellule unique, segmentation et comptages cellulaires quantitatifs dans des échantillons de cerveau humain. Dans les échantillons de cancer de la prostate, une résolution échantillonnée allant de 16 à 0,5 µm permet une imagerie tumorale 3D efficace avec une qualité d'image suffisante pour l'investigation clinique (Figs. 8, 9 ; Figs. Supplémentaires 4, 5). Pour les travaux futurs, nous voyons des opportunités (par exemple, la résolution subcellulaire pour les structures intracellulaires ou les structures neuronales axonales ou dendritiques) et la possibilité de combiner nos efforts actuels avec une résolution quasi-isotrope plus élevée. Dans de tels efforts, les approches déconvoluées à double vue et les approches à balayage axial à vue unique mériteront d'être prises en compte pour l'imagerie du cerveau et de la prostate sur de grands échantillons21,22.

un rendu 3D de la plus grande chambre d'imagerie utilisée régulièrement sur la configuration ct-dSPIM. Les chambres ont un volume de 0,9 l (20 cm × 15 cm × 3 cm). La chambre est représentée en vue de dessus (en haut), en oblique (au milieu) et en vue de côté (en bas). b Prototype de chambre imprimé avec SLS en PP. c Prototype de chambre imprimé avec SLA dans Somos®WaterShed XC 11122. Les échantillons sont montés sur des lames de verre, qui sont scellées avec du silicone pour empêcher la chambre de fuir RIMS.

a La lumière laser émise est collimatée et passe à travers une lentille accordable électroniquement (ETL) (C60-TUNELENS-100, ASI) dans le "scanner" de feuille de lumière (MM-SCAN-1.2, ASI). L'ETLf permet de contrôler électroniquement la position axiale de la taille du faisceau au niveau de l'échantillon. Suite de la légende à la page suivante. Le scanner contient un miroir MEMS 2D, qui balaie le faisceau gaussien sur l'échantillon une fois par image de caméra pour former une feuille de lumière « virtuelle » ou « numérique ». L'autre axe du miroir MEMS est utilisé pour ajuster la feuille de lumière coïncidant avec le plan focal de l'objectif de détection. b Les trajets d'imagerie sont les deux trajets lumineux possibles (trajets A et B). Pour chaque chemin, le scanner est d'un côté, et le piézo d'imagerie et la caméra sont du côté opposé. La lumière traverse les différents composants, tels que le miroir dichroïque et le filtre d'émission, comme illustré (chemins d'excitation : ligne pointillée bleue ; chemins d'émission : ligne verte continue). La fluorescence filtrée est focalisée sur une caméra sCMOS 2048 × 2048 pixels (ORCA-Flash4.0 V3, Hamamatsu) par une lentille tubulaire (C60-TUBE-B, ASI ; f = 200 mm).

L'un des aspects prometteurs de l'imagerie volumétrique montré dans cet article est le fait qu'il nous permet d'imager un grand volume de cortex humain à une résolution spatiale élevée, ce qui nous permet à son tour d'étudier les structures cellulaires sur des champs de vision étendus. À l'avenir, cela pourrait en principe permettre de quantifier les densités cellulaires pour différentes zones et couches sans biais stéréologique, puisque les comptages cellulaires dérivés ne sont pas des extrapolations à partir de sections 2D. Cependant, à ce stade, les estimations stéréologiquement dérivées des densités cellulaires doivent toujours être considérées comme l'étalon-or car elles sont bien établies. Il est donc intéressant de voir comment nos résultats de segmentation et de comptage 3D se rapportent aux données stéréologiques de la littérature. Malheureusement, les estimations de la densité cellulaire dans le cortex visuel secondaire humain sont rares. Les estimations qui ont été calculées avec des méthodes stéréologiques, telles que le fractionneur isotrope23, sont généralement données en cellules par gramme de tissu cérébral et ne sont pas simples à convertir en nos estimations de volume.

Leuba et Garey24 ont trouvé un nombre moyen de cellules dans la zone V2 de 14 7600 sous une zone corticale de 1 mm2, soit 63 700 cellules/mm3. La densité cellulaire totale dans notre ensemble de données sur toutes les couches était de 81 903 cellules/mm3. Il est peu probable que ces nombres de cellules plus élevés dans nos données résultent d'un rétrécissement des tissus induit par la compensation, car le changement observé dans la taille de nos échantillons est relativement mineur (voir Fig. 3 supplémentaire). Cela est particulièrement vrai par rapport à d'autres méthodes de nettoyage des tissus à base de solvant, qui montrent un rétrécissement des tissus beaucoup plus élevé de 30 %14 ou même jusqu'à 50 %25. Si nous prenons en compte le surcomptage observé de la segmentation cellulaire automatisée de 17 % en moyenne (Fig. 5 supplémentaire), notre nombre de cellules corrigé de 67 980 cellules/mm3 est relativement proche de Leuba et Garey. En se concentrant sur les couches individuelles, notre densité cellulaire dans la couche IV est généralement en bon accord avec Leuba et Garey avec 97 529 cellules/mm3 (nos données) contre 10 7316 cellules/mm3 24 Pour dériver les densités de toutes les cellules, nous avons multiplié leurs rapports nombre de neurones avec leur rapport neurone/glie rapporté et ajouté ces deux populations, car elles ne fournissent que des densités de population de cellules entières pour toute la zone, mais pas dans leur tableau spécifique à la couche. Malheureusement, Leuba et Garey ne répertorient pas les densités pour toutes les couches, mais rapportent les couches supragranulaires II et III, ainsi que les couches infragranulaires V et VI ensemble. Ils rapportent une densité cellulaire supragranulaire de 63 558 cellules/mm3, ce qui est similaire au nombre de cellules que nous avons trouvé dans la couche IIIa (66 884 cellules/mm3). Cependant, les couches II (71 599 cellules/mm3) et IIIb (82 712 cellules/mm3) présentent des nombres de cellules plus élevés et, par conséquent, la densité cellulaire supragranulaire combinée est également plus élevée, avec 77 807 cellules/mm3. Comme mentionné précédemment, la densité cellulaire très élevée observée dans la couche IIIb était surprenante, étant donné l'apparence visuelle de cette couche comme moins dense avec des neurones pyramidaux plus clairsemés et plus grands. Une explication possible de cet écart pourrait être un effet de volume partiel de la couche IV adjacente très dense, résultant d'une segmentation manuelle imparfaite des couches. Un autre facteur contributif probable pourrait être une tendance observée de la segmentation cellulaire automatisée à diviser les neurones plus gros en plusieurs segments lorsqu'ils présentent des différences d'intensité sur leur volume cytoplasmique (voir Fig. 5 supplémentaire). Cette tendance à segmenter les cellules plus grandes en plusieurs segments a conduit à un surcomptage moyen de la segmentation cellulaire automatisée d'environ 17 %, après que les segments inférieurs à 125 µm3 aient été filtrés. Si nous tenons compte de ce surcomptage, le nombre combiné de cellules supragranulaires de 64 580 cellules/mm3 est considérablement plus proche de Leuba et Garey. Ces deux facteurs pourraient également expliquer les densités cellulaires plus importantes observées dans nos données pour les couches V, puisque la densité élevée de la couche V (88 781 cellules/mm3) était également inattendue. Les effets de volume partiel ne pouvaient pas expliquer la densité similaire élevée de la couche VI (81 904 cellules/mm3), bien que la division des grands corps cellulaires conduise probablement encore à un surdénombrement. Par conséquent, notre densité cellulaire infragranulaire combinée est nettement supérieure à celle rapportée par Leuba et Garey (86 579 cellules/mm3 contre 53 658 cellules/mm3). Même si l'on tient compte du surcomptage de la segmentation automatisée, nos densités cellulaires infragranulaires observées seraient supérieures à celles de Leuba et Garey (71 861 cellules/mm3). Des améliorations de la qualité de la segmentation pourraient atténuer au moins certaines de ces divergences et rapprocher les estimations des cellules dans ce domaine des estimations stéréologiques. Zhao et al. utiliser une segmentation basée sur l'apprentissage en profondeur sur les données volumétriques du cerveau humain nettoyé14. Il convient de noter que les auteurs de cet article rapportent des densités beaucoup plus élevées (16 2000–21 6000 cellules/mm3) que Leuba et Garey ou que les travaux rapportés ici, bien qu'ils n'aient pas étudié différentes zones.

Un aspect possible qui pourrait expliquer la variation du nombre de cellules dans ces approches est également la quantité de rétrécissement introduite au cours du traitement histologique. Étant donné que l'approche de compensation des tissus utilisée dans cette étude est différente de celle de Zhao et al. 26, et connu pour produire un rétrécissement relativement mineur (12 % contre 30 % rapportés dans Zhao et al. ; voir la Fig. 3 supplémentaire), cela pourrait expliquer, au moins en partie, cet écart. Une autre étude récemment publiée qui appliquait un pipeline de segmentation cellulaire très sophistiqué27 a de nouveau donné des résultats très différents avec des densités de neurones de 14 000 à 24 000 neurones/mm3 (ce qui signifie environ 28 000 à 47 500 cellules/mm3 en appliquant le rapport neurone/glie de Leuba et Garey). L'approche de compensation utilisée dans cette étude est un protocole de compensation de tissu aqueux, qui élargit le tissu. Cela pourrait à son tour expliquer les estimations inférieures. En outre, ils s'appuient sur le marquage des anticorps pour identifier les populations de cellules neuronales, plutôt que sur un colorant organique plus général avec un poids moléculaire plus faible, ce qui pourrait également expliquer certaines des différences observées. Enfin, il est également possible que la méthode stéréologique 2D déployée par Leuba et Garey conduise à un sous-dénombrement systématique, lors de l'extrapolation des comptages cellulaires 2D sur coupes à un grand volume de tissu.

Le diagnostic histo-pathologique classique du cancer de la prostate, en particulier des tumeurs multifocales, est difficile3. De plus, l'évaluation de l'ensemble de la biopsie au trocart, ou la résection de l'ensemble de l'échantillon, prendrait jusqu'à 10 jours, ce qui est inefficace et très coûteux, et presque jamais réalisé dans la pratique clinique standard. Par conséquent, une éventuelle imagerie Mosaic ct-dSPIM de la prostate, en collaboration avec des oncologues et des pathologistes de l'hôpital local, ouvre de nouvelles voies pour les futurs diagnostics du cancer.

Des travaux récents ont démontré l'utilité du LSFM pour examiner des biopsies à l'aiguille centrale de la prostate humaine de 1 à 2,5 mm d'épaisseur au moyen d'un système LSFM à toit ouvert construit à la maison. Au lieu de cela, ici, des coupes axiales complètes de prostate de 5 mm d'épaisseur ont été examinées avec les deux scans Mosaic 16 et 4 ct-dSPIM dans un délai d'env. 1 à 5 h, ce qui est efficace dans le temps et permet une évaluation d'ensemble relativement rapide de l'ensemble de la biopsie (Figs. 6, 7 ; Figs. 1, 2 supplémentaires ; Vidéo supplémentaire 5). De plus, cela permet un examen rétrospectif d'un très grand nombre d'échantillons archivés de cancer de la prostate (jusqu'à 8 échantillons par jour). L'imagerie 3D à grand volume peut permettre la visualisation de tumeurs dans des couches ou des régions plus profondes, et dans l'ensemble de l'échantillon de résection de la prostate épaisse. Cela a le potentiel de fournir de nouvelles informations sur la structure des tissus prostatiques cancéreux et bénins. À ce jour, les informations actuelles sur l'architecture 3D de la prostate sont limitées, car elles sont basées sur l'examen IRM, qui ne permet pas une analyse détaillée et à haute résolution de l'organe complet, y compris la formation des glandes, la lumière et la couche épithéliale. Cependant, dans la pratique histo-pathologique actuelle, la technique la plus fréquemment utilisée est une combinaison de microscopie à fond clair classique et de trois à quatre niveaux de coupes de tissus de 5 µm d'épaisseur, ce qui donne des informations sur les tissus 2D. Cela peut conduire à un sous-classement de la tumeur ou à un diagnostic faux négatif en cas de carcinome multifocal, car ceux-ci sont principalement présents aux niveaux profonds des blocs de tissus. Par conséquent, il est très important pour le pathologiste et l'oncologue d'obtenir de nouveaux aperçus 2D et 3D à haute résolution et à haut volume de l'architecture détaillée de la tumeur de la prostate à l'aide d'échantillons de prostate de patients de 5 mm d'épaisseur (Figs. 6, 7 ; Figs. 1, 2 supplémentaires ; Vidéo supplémentaire 5). L'imagerie quantitative par feuille de lumière de ces échantillons de cancer de la prostate plus épais (prostatectomie) peut améliorer la précision des diagnostics. Les résultats de cette étude montrent qu'il est possible de détecter des tumeurs avec notre méthode d'imagerie ct-dSPIM des tissus dégagés et même de permettre la gradation du score de Gleason (Fig. 2 supplémentaire), y compris la détection du processus néoplasique et de distinguer le tissu prostatique bénin normal. d'un adénocarcinome. Les scans Mosaic 16 (Figs. 6, 7) et Mosaic 4 (Figs. 1, 2 supplémentaires; Vidéo supplémentaire 5) ont permis la détection de tumeurs dans la section axiale de la prostate à montage complet chez différents patients.

De plus, étant donné que les acquisitions Mosaic sur le ct-dSPIM permettent un examen 3D à grande vitesse d'échantillons de prostate à grande échelle, il est possible de développer des pipelines d'imagerie à haut débit, pour env. 20 échantillons en 10 jours, si un seul échantillon est imagé à la fois. Le traitement standard de la prostate comprend au moins 24 h de fixation, suivi d'une macroscopie et d'un traitement dans un processeur de tissu d'infiltration sous vide (au moins 24 h). Ainsi, cette étape pourrait être omise par l'application de l'approche MASH et ct-dSPIM proposée sur un échantillon de résection frais. Cela pourrait potentiellement avoir un effet considérable sur la pratique clinique et accélérer le flux de travail de diagnostic. Compte tenu de la taille du conteneur d'imagerie (voir Fig. 8), plusieurs échantillons pourraient être logés en parallèle dans le ct-dSPIM, rendant potentiellement l'imagerie encore plus efficace. Cela peut entraîner une collecte rapide de connaissances et est réalisable pour divers échantillons de patients à différents stades de la maladie tout en fournissant des données suffisantes pour les statistiques et la quantification de la variation et de la localisation de la tumeur.

En résumé, notre méthode a le potentiel d'améliorer l'imagerie des échantillons de résections de cancer de la prostate humaine. Il fournit une nouvelle visualisation 3D de l'ensemble de l'échantillon en détail, ce qui est irréalisable en temps et en ressources avec les méthodes traditionnelles. Cela pourrait également conduire à une imagerie plus rapide de la prostate, ce qui présente des avantages pour l'efficacité de la pratique clinique, ainsi qu'à de nouvelles opportunités pour la recherche (sur les tissus d'archives). De plus, cela pourrait fournir des diagnostics plus précis, en particulier dans les carcinomes multifocaux.

Nous avons démontré l'imagerie Mosaic à grande échelle sur le système ct-dSPIM et montré que nous étions capables de surmonter les limitations d'autres microscopes à feuille de lumière existants pour une très grande couverture d'échantillons humains16,28. Le ct-dSPIM utilise une géométrie oblique avec les objectifs plongeant directement dans le liquide d'imagerie par le haut, contrairement à d'autres configurations récemment publiées17,28. Dans les systèmes antérieurs, les objectifs sont situés sous l'échantillon, ce qui nécessite une imagerie à travers le fond en verre de la chambre. La taille de l'échantillon est potentiellement encore limitée par cette géométrie car la distance de travail (WD) est effectivement perdue par l'imagerie à travers le verre et une lentille supplémentaire. D'autres systèmes utilisent une géométrie de feuille de lumière plus standard (c'est-à-dire verticale et non oblique) et utilisent une nouvelle façon de générer la feuille de lumière elle-même pour imager de très grands échantillons11. Dans ces systèmes, l'étendue latérale sera finalement limitée, car même dans les échantillons les plus transparents, la diffusion de la lumière se produira dans une certaine mesure et la qualité de l'image plus profondément dans le tissu se détériorera. Cela peut être évité avec une configuration oblique telle que le ct-dSPIM, laissant la taille latérale de l'échantillon limitée uniquement par la plage de déplacement de la platine du microscope.

D'autres modifications matérielles, telles qu'un scanner à lentille cylindrique (plutôt qu'une feuille de lumière laser à balayage numérique) et des ajustements de trajectoire de carrelage de scène, tels qu'une trajectoire en serpentin, pourraient potentiellement augmenter encore la vitesse d'imagerie de 2 à 4 fois. Cela ouvrirait une toute nouvelle échelle dans l'étude des tissus cérébraux sains et malades post-mortem. D'autres modifications matérielles de la configuration ct-dSPIM, telles que des objectifs NA et de grossissement plus élevés, ainsi qu'une approche de feuille de lumière à balayage axial, pourraient potentiellement permettre une augmentation de la résolution pour l'imagerie au détriment du champ de vision ou du temps de image la même taille d'échantillon. Ces développements futurs pourraient permettre l'imagerie de différentes structures et marqueurs dans de plus grandes parties du cerveau, avec le potentiel de fournir de nouvelles informations sur la neuroanatomie humaine saine et pathologique.

De plus, l'établissement d'autres options de marquage, telles que le marquage de petites molécules de l'angio-architecture cérébrale, ainsi que des stratégies de marquage d'anticorps qui conviennent également à l'imagerie de grands échantillons ct-dSPIM, pourraient encore étendre les possibilités. À l'avenir, l'ensemble du pipeline, du traitement des tissus (avec compensation et étiquetage MASH) à l'imagerie ct-dSPIM Mosaic et à l'analyse des données, pourrait être étendu à de plus grandes parties du cerveau et des régions cérébrales, telles que l'ensemble du lobe temporal ou occipital en 3– Dalles de 5 mm d'épaisseur. Comme la taille de l'échantillon latéral peut potentiellement être beaucoup plus grande dans la configuration actuelle, il serait même possible d'imager des tranches de cerveau entier, à condition qu'un pipeline de traitement des tissus pour des échantillons de cette taille soit établi.

Bien que nous ayons démontré l'utilisation de MASH préparé humain et de la prostate comme cas d'application pour des acquisitions à grande échelle sur le ct-dSPIM, cette technique pourrait également être étendue à une variété d'autres tissus de mammifères humains et non humains. Cela pourrait faire de la combinaison de MASH avec l'imagerie ct-dSPIM un outil puissant pour les études anatomiques et pathologiques en général.

En conclusion, nous avons pu démontrer que le ct-dSPIM est un excellent outil pour une imagerie quantitative efficace de la feuille de lumière 3D de très grands échantillons de tissus humains. Nous avons pu montrer l'application de l'imagerie ct-dSPIM à des échantillons de cerveau humain post-mortem optiquement effacés à l'échelle cm3 (lobe occipital) et d'échantillons de cancer de la prostate (sections axiales de la prostate entière). Au moyen d'une vue d'ensemble rapide et suivie d'analyses en mosaïque haute résolution des ROI identifiées, nous avons pu effectuer le comptage des cellules cérébrales humaines dans les échantillons de lobe occipital et la notation du score de Gleason dans les sections axiales de la prostate entière. À l'avenir, l'imagerie ct-dSPIM a le potentiel d'être appliquée dans des enquêtes fondamentales et cliniques plus larges sur des échantillons de tissus volumineux.

Des échantillons de lobe occipital humain ont été prélevés sur 3 donneurs de corps humains (donneur 1 : homme, 98 ans ; donneur 2 : femme, 101 ans ; donneur 3 : femme 90 ans ; aucune maladie neuropathologique connue, respectivement) du programme de don de corps du Département d'anatomie et d'embryologie, Université de Maastricht (UM). Les tissus des donneurs 2 et 3 ont été utilisés pour l'évaluation du rétrécissement (Fig. 3 supplémentaire). Les donneurs de tissus avaient donné leur consentement éclairé et écrit au don de leur corps à des fins d'enseignement et de recherche, conformément à la loi néerlandaise sur l'utilisation des restes humains à des fins de recherche scientifique et d'enseignement ("Wet op de Lijkbezorging"). En conséquence, un codicille manuscrit et signé du donneur posé alors qu'il était encore vivant et en bonne santé, est conservé au Département d'anatomie et d'embryologie, UM, Maastricht, Pays-Bas. Les cerveaux humains ont d'abord été fixés in situ par perfusion corporelle complète via l'artère fémorale. Sous une pression de 0,2 bar, le corps a été perfusé par 10 l de liquide de fixation (1,8 % en volume de formaldéhyde, 20 % d'éthanol, 8,4 % de glycérine dans de l'eau) en 1,5 à 2 h. Par la suite, le corps a été conservé au moins 4 semaines pour la post-fixation, immergé dans le même fluide. Par la suite, des échantillons de cerveau ont été récupérés par dissection du crâne et stockés dans du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,1 M pendant 14 à 30 mois.

Tous les spécimens de résection de la prostate ont été extraits des archives du Département de pathologie du Centre médical universitaire de Maastricht (MUMC+) entre 2007 et 2015. Pour cette publication, trois échantillons ont été utilisés. Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique médicale du centre médical universitaire de Maastricht aux Pays-Bas (2020-1537). Tous les spécimens ont été collectés et étudiés conformément au protocole du Code de conduite néerlandais pour la recherche observationnelle avec des données personnelles et des tissus (2004)29. Les échantillons ont été reçus à des fins de diagnostic et traités selon les procédures opératoires standard internes conformément aux recommandations nationales et internationales. L'épaisseur de la section axiale entière de l'échantillon de prostate varie entre 3 et 5 mm. En bref, les échantillons ont d'abord été fixés avec du formol tamponné à 4 % pendant 24 h et ensuite traités dans le Vacuum Infiltrating Processor Tissue Tek VIP6 (Sakura Finetek USA, Inc, Torrance, CA, USA), où les échantillons ont été déshydratés par immersion dans une série de solutions d'éthanol de concentration croissante jusqu'à l'obtention d'un alcool pur et sans eau. Cette étape a été suivie d'un nettoyage du tissu dans une solution de xylène, avec paraffine d'infiltration d'échantillon conséquente. Enfin, les échantillons ont été inclus dans de la paraffine conformément aux procédures de diagnostic de pathologie de routine du centre d'intégration HistoCore Arcadia (Leica Microsystems BV, Amsterdam, Pays-Bas).

Tous les échantillons ont été nettoyés et étiquetés avec du rouge neutre en utilisant le protocole MASH-NR comme décrit dans notre publication précédente19. Étant donné que le protocole clinique standard de la prostate produisait des échantillons inclus dans la paraffine fixée au formol (FFPE), un protocole MASH modifié a été utilisé (FFPE-MASH-NR) pour traiter les échantillons de prostate FFPE. Dans le protocole FFPE-MASH-NR, les échantillons de prostate devaient être déparaffinés avant la compensation MASH standard. À cette fin, les échantillons ont été incubés pendant 3 à 7 jours dans du xylène en fonction de la taille de l'échantillon (pour chaque échantillon, un volume de xylène d'environ 200 ml a été utilisé). Les blocs de paraffine ont été taillés manuellement autant que possible avant l'incubation. Après cela, les échantillons ont été réhydratés 1 h chacun dans 100 ml de xylène, 2 × 100 %, 70 %, 50 % d'éthanol (EtOH) et enfin PBS. Les échantillons réhydratés ont été conservés dans une solution PFA tamponnée à 4 % jusqu'à leur utilisation. La compensation et l'étiquetage des échantillons avec FFPE-MASH ont suivi les mêmes étapes décrites ci-dessous pour les échantillons de cerveau. Au cours de toutes ces étapes, les échantillons de prostate ont été conservés dans des récipients en verre individuels et incubés dans au moins 50 ml de la solution respective. Les contenants étaient conservés dans un shaker en tout temps.

Tous les échantillons ont été nettoyés et étiquetés avec du rouge neutre en utilisant le protocole MASH-NR comme décrit dans notre publication précédente19. En bref, les échantillons ont été déshydratés pendant 1 h chacun dans un mélange aqueux (v/v) de 20, 40, 60, 80 et 100 % de méthanol (MeOH) à température ambiante (RT) et 1 h dans 100 % MeOH à 4 °C. Après cela, les échantillons ont été blanchis pendant une nuit dans une solution fraîchement préparée et réfrigérée de 5 % de H2O2 dans du MeOH à 4 °C. Les échantillons ont ensuite été réhydratés pendant 1 h chacun dans 80 %, 60 %, 40 %, 20 % MeOH et perméabilisés dans une solution saline tamponnée au phosphate + 0,2 % (v/v) Triton X-100 pH 7,4. Cela a été suivi d'une incubation de 1 h dans une solution aqueuse fraîchement filtrée de disulfite de potassium à 50 % (p/v) et de 5 rinçages rapides suivis d'un lavage de 1 h dans de l'eau distillée. Le marquage pour la cytoarchitecture a été effectué pendant 5 jours dans une solution de 0,001% de rouge neutre dans un tampon phosphate-citrate (alias tampon McIlvain)30 à pH 4. Les échantillons ont été retournés après la moitié du temps d'incubation. Après marquage, les échantillons ont été lavés 2 x 1 h dans du tampon McIlvain pH 4 et déshydratés pendant 1 h chacun dans 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 2 x 100 % MeOH. La délipidation a été effectuée pendant une nuit dans du dichlorométhane à 66 % (DCM)/MeOH à 33 %, suivie de 2 x 1 h de DCM à 100 %. Enfin, les échantillons ont été incubés avec du cinnamate d'éthyle (ECi) comme solution d'adaptation d'indice de réfraction (RIMS). Toutes les étapes ont été réalisées à TA.

Pour l'incubation de plusieurs tranches coronales de lobes occipitaux entiers, un bocal en verre de 8 cm de diamètre a été utilisé, avec des entretoises en polyéthylène ou en polytétrafluoréthylène, afin d'assurer la compatibilité avec les solvants organiques utilisés lors de la délipidation. Pour empêcher les entretoises en plastique de laisser des impressions sur le tissu, des morceaux de papier filtre ont été placés au-dessus et au-dessous du tissu. Le bocal en verre a été complètement rempli pour chaque étape décrite ci-dessus (un volume d'environ 200 ml) et les solutions ont été constamment agitées avec un agitateur magnétique pendant tout le traitement.

Afin d'évaluer le rétrécissement tissulaire induit par MASH, nous avons mesuré la surface d'un total de 13 tranches de cerveau provenant de trois donneurs différents (échantillon "Occlobe16" n = 4, tissu du même donneur comme indiqué sur les Figs. 3–7 ; échantillon "Occlob10" n = 6 ; échantillon "Hemi6" n = 3, coupes coronales antérieures au lobe occipital). Les tranches "Occlobe10" (n = 6) ont été prises à partir d'un autre lobe qui a été imagé pour un projet indépendant. Des tranches "Hemi6" (n = 3) ont été prélevées à partir de matériel pré-sectionné fourni par le Département d'anatomie et d'embryologie de l'Université de Maastricht. Ces sections de cerveau coronales coupées manuellement d'env. 1 cm d'épaisseur ont ensuite été découpés en échantillons de 5 mm d'épaisseur, avant le traitement MASH. Des images numériques mises à l'échelle ont été prises avant le nettoyage et à la fin de la procédure de nettoyage, après l'appariement RI. La circonférence des tranches de tissu a été segmentée manuellement dans FIJI et la zone avant et après le nettoyage a été mesurée (Supplément Fig. 3).

Pour l'imagerie ct-dSPIM, de grandes chambres d'imagerie personnalisées (20 × 15 × 3 cm, volume d'environ 900 ml) (Fig. 8) ont été imprimées en 3D dans un matériau de bassin versant résistant à l'ECi (Somos®WaterShed XC 11122) ou en polypropylène (PP ). L'impression a été réalisée soit par SKM Rapid Modeling bv (Helmond, Pays-Bas) via la stéréolithographie (SLA) pour les impressions du bassin versant, soit produite via le frittage sélectif au laser (SLS) par Materialise NV (Louvain, Belgique) pour les chambres en PP. La zone d'imagerie des chambres était équipée d'une lame de verre de 178 × 127 × 1, 2 mm (Ted Pella Inc., Redding, États-Unis) comme fond pour diminuer les réflexions de la lumière et collée avec un mastic en silicone pur. Tous les échantillons ont été collés sur la lame de verre dans la chambre d'imagerie imprimée en 3D avec de la colle chaude (Rapid AB, Hestra, Suède). Ensuite, la chambre d'imagerie a été remplie d'au moins 500 ml de solution ECi (RI 1,56) avec de plus grandes quantités en fonction de la taille de l'échantillon.

Le microscope ct-dSPIM est destiné à l'imagerie 3D de très grands échantillons de tissus clairs d'une épaisseur allant jusqu'à 5 mm et d'une taille latérale limitée uniquement par les limites de déplacement et de temps d'imagerie de l'étage XY. Il a été dérivé du système diSPIM (microscopie à illumination plane sélective inversée à double vue)31 et co-développé avec Applied Scientific Instrumentation Inc. (ASI, Eugene, États-Unis). Un schéma optique du système ct-dSPIM est illustré à la Fig. 9. La source de lumière laser (Coherent obis, laser line 552 nm LS 40 mW LASER SYSTEM : FIBER PIGTAIL : FC) a une sortie de fibre monomode avec un ouverture (NA) de 0,12. La lumière laser émise est collimatée et passe à travers une lentille accordable électroniquement (ETL) (C 60-TUNELENS-100, ASI) dans le "scanner" de feuille de lumière (MM-SCAN-1.2, ASI). La lentille accordable permet de contrôler électroniquement la position axiale de la taille du faisceau au niveau de l'échantillon. Le scanner contient un miroir micro-électro-mécanique 2D (MEMS) qui balaie le faisceau gaussien à travers l'échantillon une fois par image de caméra pour former une feuille de lumière "virtuelle" ou "numérique". L'autre axe du miroir MEMS est utilisé pour ajuster le l coïncidant avec le plan focal de l'objectif de détection. Le faisceau de balayage est relayé vers le plan focal arrière de l'objectif d'éclairage à immersion multiple (#54-10-12, Special Optics/Applied Scientific Instrumentation (ASI).

La fluorescence est collectée par un objectif de détection multi-immersion identique (#54-10-12, Special Optics/ASI) et donne une résolution d'environ 1 μm latéralement (selon le RI de la solution d'imagerie). Les objectifs sont compatibles avec une plage d'indice de réfraction (RI) de 1,33 à 1,56 et une distance de travail (WD) de 12 mm. L'ouverture numérique (NA) et la distance focale effective (EFL) varient avec l'indice de réfraction, mais pour ECi, la NA est d'environ 0,43, l'EFL est de 11,2 mm et le grossissement est de 17,9 ×. La profondeur d'imagerie maximale est de 5 mm et est limitée par le dégagement physique des deux objectifs. Les objectifs sont tenus par des mécaniques qui incluent des réglages fins manuels pour co-aligner les deux objectifs (SPIM-DUAL-K2, ASI).

Les voies d'excitation et de détection sont combinées sur un miroir polychroïque (ZT488/543/635rpc-UF2, Chroma) et une roue à filtres motorisée (FW) (FW-1000-8, ASI) à trois filtres d'émission (ET519/26 m ; ET576 /31 m; ET655lp, Chroma), qui permet une imagerie en trois couleurs. Dans ce travail, l'objectif était une imagerie monochrome efficace sur de très grands volumes et seule la bande de couleur médiane avec le filtre d'émission ET576/31 m a été utilisée. La fluorescence filtrée est focalisée sur une caméra scientifique Complementary Metal–Oxide–Semiconductor (sCMOS) de 2048 × 2048 pixels (ORCA-Flash4.0 V3, Hamamatsu) par une lentille tubulaire (C60-TUBE-B, ASI; f = 200 mm) . La lentille du tube fournit un échantillonnage de Nyquist de 0,3625 μm/pixel à un RI de 1,56, avec un champ de vision horizontal de 0,74 mm sur les 2048 pixels de la caméra.

Les bandes d'images sont collectées avec une combinaison de balayage par étapes (c'est-à-dire que l'échantillon est déplacé à travers une feuille de lumière stationnaire à l'aide de l'étage XY, Fig. 4 supplémentaire), de carrelage latéral / vertical à l'aide d'un étage XY motorisé (MS-8000, optimisé pour le balayage ) et actionneurs Z motorisés (Focusing Translation Platform (FTP-2050), ASI). La vitesse d'acquisition est >108 voxels/sec à un temps d'exposition de 10 ms. Le micrologiciel de balayage de scène émet un déclencheur TTL interne (durée de vie) qui assure le positionnement de départ reproductible (<1 μm) de chaque bande d'image. Un contrôleur ASI Tiger Controller (TG-1000) contient des composants électroniques de commande pour les étages motorisés, un miroir MEMS, un objectif réglable et des déclencheurs de caméra et de laser. Il synchronise tous ces éléments avec une précision inférieure à la milliseconde au cours de chaque bande d'image en fonction du déclencheur de balayage initial.

Le microscope est contrôlé par µManager 1.4.22, un logiciel de contrôle de microscope open-source gratuit32. Le plug-in ASI diSPIM dans µManager est utilisé à la fois pour aligner le microscope et pour configurer et effectuer des acquisitions. Le plug-in de contrôle de scène est utilisé pour effectuer des ajustements ETL statiques sur les deux ETL (V, gauche ; W, droite).

Pour certaines applications, les informations 3D d'une seule vue ou pile suffisent. Cependant, pour le grand échantillon d'imagerie ciblé ici, un pavage extensif est utilisé le long des acquisitions yz Mosaic, généralement en combinaison avec une longue étape de piles d'images numérisées dans la direction x (Fig. 4 supplémentaire). En tant que système à double vue, le ct-dSPIM présente l'avantage supplémentaire que le rôle des deux objectifs peut être inversé pour collecter une autre pile à partir d'une direction perpendiculaire au prix de deux fois le temps d'imagerie. Cependant, étant donné que l'accent est mis ici sur l'imagerie rapide à grand volume de résolution> 1 μm, le mode d'imagerie à double vue n'est pas utilisé dans ce travail.

L'échantillon de tissu de cerveau et de prostate humain marqué MASH-NR a été imagé avec la ligne laser de 552 nm à 1 mW (OBIS) et avec un temps d'exposition de 10 ms tout au long. Pour les deux échantillons, une analyse d'ensemble de l'ensemble des tranches de tissu à l'échelle du centimètre cube a été réalisée avec une résolution échantillonnée isotrope de 16,4 µm (que nous appelons une acquisition Mosaic 16). De plus, pour l'échantillon de cerveau humain, nous avons effectué une analyse multi-échelles consistant en : (a) une analyse d'ensemble Mosaic 16 de la tranche de tissu entière, (b) une acquisition pour un grand FoV sélectionné (~ 15 × 17 × 3 mm) avec une résolution échantillonnée isotrope de 4,1 µm (appelée Mosaic 4) et (c) une acquisition pour un FoV plus petit (~ 5 × 10 × 3 mm) avec une haute résolution (0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm) pour une région d'intérêt spécifique ( appelé mosaïque 0,5). La vitesse d'imagerie est différente selon l'imagerie Mosaic déployée. Pour les balayages d'ensemble Mosaic 16 rapides, la vitesse d'imagerie est de 1,7 h/1 cm3 et pour les balayages ROI Mosaic 4 et Mosaic 0,5 à résolution plus élevée, la vitesse d'imagerie est de 5 h/1 cm3 et 15,8 h/1 cm3, respectivement (Tableau 2).

Alors que les scans Mosaic 16 fournissent des ensembles de données 3D d'un bloc de tissu entier à une résolution d'échantillonnage mésoscopique isotrope de 16,4 µm, les mosaïques 4 et Mosaic 0,5 montrent des régions d'intérêt à une résolution d'échantillonnage isotrope de 4,1 µm et de près de 1 µm, respectivement. Les pas de coupe à l'acquisition sont de 11, 60 µm pour Mosaic 16, 2, 90 µm pour Mosaic 4, ce qui conduit à des résolutions échantillonnées isotropes après redressement en raison de la mise à l'échelle √ 2 (Fig. 4 supplémentaire). Les ensembles de données brutes ont ensuite été sous-échantillonnés comme suit : pour Mosaic 16, 16× dans le plan (32 × 45 pixels), et pour Mosaic 4, 4× (128 × 186 pixels), pour correspondre à la taille de pas du microscope et produire un isotrope jeu de données de 16,4 µm (Mosaic 16) ou 4,1 µm (Mosaic 4) isotrope après redressement. Pour le Mosaic 0.5, le pas de coupe était de 0,363 µm et un sous-échantillonnage dans le plan de 2 × 2 a été effectué. Avec ces paramètres, les balayages du Mosaic 16 sont acquis à la vitesse la plus élevée possible, limitée uniquement par la vitesse de balayage maximale de l'étage. Les scans Mosaic 4 sont acquis à proximité d'un échantillonnage de Nyquist de la résolution optique axiale d'environ 8 µm (c'est-à-dire l'épaisseur théorique de la feuille de lumière), et les scans Mosiac 0,5 sont acquis à proximité d'un échantillonnage de Nyquist de la résolution optique dans le plan latéral d'environ 1 µm. résolution. Lors de l'acquisition de volumes d'image avec le ct-dSPIM, qui utilise le balayage de scène pour déplacer l'échantillon à travers le plan d'imagerie (c'est-à-dire la feuille de lumière), les axes ne correspondent pas aux coordonnées XYZ orthogonales. Au lieu de cela, l'axe Z de la caméra est à un angle de 45 ° par rapport à la direction de balayage de la scène (Fig. 4 supplémentaire). Par conséquent, l'acquisition d'images numérisées par scène conduit à une forme de pile parallélépipédique asymétrique avec des axes non orthogonaux, qui seront déformés lorsqu'ils seront visualisés dans le système d'axes orthogonaux. Une opération de redressement transforme la pile parallélépipédique asymétrique en une pile rectangulaire avec les axes orthogonaux traditionnels (Fig. 1b supplémentaire). L'étiquetage de l'axe utilisé dans les figures de ce travail est l'étiquetage de l'axe de la visionneuse d'image avec l'axe x le long de l'épaisseur de 3 à 5 mm du tissu et l'axe z le long de la direction de balayage des piles d'images (Fig. 4c supplémentaire).

Le sous-échantillonnage est effectué en mettant les images à l'échelle à la taille de pixel finale avec la fonction de mise à l'échelle de Fiji33. Le sous-échantillonnage a réduit la taille de l'ensemble de données à environ 3 à 4 Go pour un scan Mosaic 16 d'une tranche de lobe occipital entier. Ces données sous-échantillonnées ont ensuite été traitées avec le plug-in FIJI BigSticher34. Tout d'abord, les données ont été redressées à l'aide de l'option "(de)skewing", puis assemblées via l'option Phase Correlation, sans autre sous-échantillonnage. Les données assemblées ont ensuite été réenregistrées sous forme de fichier tif 16 bits. Dans certains cas, pour la visualisation, l'ensemble de données fusionné isotrope final a été retranché dans FIJI le long de la direction YZ pour fournir une vue coronale sur les échantillons. Le temps de sous-échantillonnage global pour un balayage Mosaic 16 et Mosaic 4 prend 12 h sur un poste de travail PC avec 32 RAM, Intel(R) Xeon(R) CPU E5-1650 v3 à 3,50 GHz et 10 disques durs. De plus, pour un Mosaic 0.5, aucun sous-échantillonnage n'est nécessaire. Le temps d'assemblage total avec le plug-in BigStitcher prend environ 1 h pour le Mosaic 16 et 2 h pour le scan Mosaic 4, respectivement. Pour le Mosaic 0.5, environ 3 jours de temps de couture sont nécessaires dans BigStitcher.

La visualisation 3D et le comptage cellulaire des piles de volume ont été effectués avec le logiciel arivis Vision4D (version 3.4.0). Pour cela, un seul stack issu d'une acquisition Mosaic 0.5 dans la zone V2 du cerveau humain et couvrant toutes les couches corticales, a été utilisé. La pile redressée, cousue et retranchée a été traitée avec un pipeline automatisé dans Vision4D. Les données brutes ont d'abord été filtrées avec l'option de filtre morphologique et les cellules ont été segmentées avec la méthode de segmentation « blob finder ». Pour dériver le nombre de cellules par couche, les couches corticales et la matière blanche ont été segmentées manuellement avec l'outil de sélection de polygones sur tout le volume. La couche III a été divisée en deux sous-couches IIIa et IIIb sur la base de différences notables de densité et de taille de cellule (par exemple, de grands neurones pyramidaux apparaissant dans la couche IIIb). Un deuxième pipeline a ensuite été appliqué pour créer des compartiments basés sur les couches segmentées manuellement, qui ne comprenaient que les objets segmentés du pipeline de segmentation cellulaire qui étaient entièrement contenus dans les bordures de segment de couche et avaient une taille supérieure à 125 µm3. Les caractéristiques dérivées de ces segments compartimentés ont ensuite été extraites dans des tableaux itemised.csv.

Pour visualiser la résolution isotrope des ensembles de données Mosaic 16 et Mosaic 4 à résolution inférieure, des vues orthogonales ont été créées dans FIJI33 en retranchant les données et en créant des MIP pour chaque axe. Les vidéos ont été créées à la fois avec FIJI et avec Vision4D. Les figures ont été créées avec biorender (https://www.biorender.com).

Afin de valider le pipeline de segmentation cellulaire automatisé, un comptage manuel des cellules a été effectué sur le même ensemble de données. Le volume de données a été divisé en une grille de 100 × 100 µm, s'étendant sur toute la profondeur de la pile, dans l'environnement Vision4D avec un script python sur mesure. Par la suite, 10 avions et 5 ROI différents par avion ont été sélectionnés de manière pseudo-aléatoire à l'aide de la fonction "randi" dans MATLAB (R2015b, MathWorks Inc.) comme générateur de nombres aléatoires. Les cellules ont été comptées manuellement dans chaque ROI, en ne considérant que les cellules entièrement contenues dans les limites de la ROI ou se croisant avec la bordure gauche et / ou inférieure de la boîte de 100 × 100 µm (Fig. 3A supplémentaire). Des tracés de violon de la distribution des données ont été créés dans MATLAB à l'aide du script de Bechtold (2016 ; https://doi.org/10.5281/zenodo.4559847) pour les cellules comptées manuellement, les résultats de segmentation "blob finder" non filtrés, ainsi que les résultats filtrés ne contenant que des segments supérieurs à 125 µm3 ("corps cellulaires filtrés"; Fig. 5b supplémentaire).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données brutes de microscopie sont stockées sur un serveur local de la faculté. Les données de source numérique pour la validation du cerveau humain et les mesures de rétrécissement sont présentées dans les données supplémentaires 1 et 2. Toutes les autres données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous remercions Maurizio Abbate (Arivis AG) d'avoir gentiment fourni le script python sur mesure pour l'environnement Vision4D afin de diviser le volume de données en une grille de 100 × 100 µm. De plus, nous remercions le Dr Jon Daniels (Applied Scientific Instrumentation) pour ses conseils techniques et pour avoir fourni à la Fig. 9 la disposition optique du ct-dSPIM. Ce projet a été partiellement financé par une bourse Veni AES 2020 du programme Talent de la fondation scientifique néerlandaise (NWO), qui a été attribuée au Dr Schueth (numéro de dossier : 18139). Le professeur Roebroeck a été soutenu par une subvention de démarrage ERC (MULTICONNECT, #639938) et une subvention VIDI de la Fondation néerlandaise des sciences (NWO) (#14637).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Anna Schueth, Sven Hildebrand.

Département de neurosciences cognitives, Faculté de psychologie et neurosciences, Université de Maastricht (UM), Maastricht, Pays-Bas

Anna Schueth, Sven Hildebrand, Shubharthi Sengupta, Annemarie Kiessling, Michael Capalbo et Alard Roebroeck

Département de pathologie, Maastricht University Medical Center (MUMC+), Maastricht, Pays-Bas

Iryna Samarska & Axel zur Hausen

Département d'anatomie, Université de Maastricht (UM), Maastricht, Pays-Bas

Andreas Herrler

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AS a réalisé toutes les expériences de microscopie à feuille de lumière, a fait fonctionner le microscope ct-dSPIM avec maintenance et a travaillé sur le co-développement du prototype (avec Applied Scientific Instrumentation, ASI, Eugen, Oregon, États-Unis) ; SH a effectué la préparation des échantillons, la compensation optique et a développé le protocole FFPE-MASH ; SH et AS ont fait les chiffres et l'analyse ; SS a fourni une assistance pour l'impression 3D des chambres d'imagerie ; AK a fourni une assistance en laboratoire (nettoyage optique et acquisition d'images) ; AH a fourni le tissu cérébral humain et l'expertise sur l'anatomie humaine ; IS et AzH étaient les pathologistes de ce projet et ont fourni du matériel sur le cancer de la prostate, une expertise sur le cancer de la prostate et ont fait le score de Gleason du matériel du patient ; AR a conçu l'étude, le co-développement du prototype de microscope ct-dSPIM et a assuré la supervision ; MC a fait la co-supervision; AS, SH, AR et MC ont rédigé l'article. Tous les auteurs ont lu, commenté et/ou édité l'article.

Correspondance à Anna Schueth ou Alard Roebroeck.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Ludovico Silvestri et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Chao Zhou et Karli Montague-Cardoso.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Schueth, A., Hildebrand, S., Samarska, I. et al. Imagerie efficace en feuille de lumière 3D d'échantillons de tissu cérébral et prostatique humain à très grande échelle. Commun Biol 6, 170 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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Reçu : 26 juillet 2022

Accepté : 26 janvier 2023

Publié: 13 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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