Coloration histologique virtuelle de l'étiquette - Nantong Histologie Consommables Co., Ltd

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 10296 (2022) Citer cet article

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Les visualisations histopathologiques sont un pilier de la médecine moderne et de la recherche biologique. L'oncologie chirurgicale s'appuie exclusivement sur l'histologie post-opératoire pour déterminer le succès chirurgical définitif et guider les traitements adjuvants. Le flux de travail actuel de l'histologie est basé sur l'évaluation microscopique en champ clair des tissus histochimiques colorés et présente certaines limitations majeures. Par exemple, la préparation d'échantillons colorés pour l'évaluation en fond clair nécessite un long traitement des échantillons, retardant les interventions pendant des jours, voire des semaines. Par conséquent, il existe un besoin pressant pour des procédés d'histopathologie améliorés. Dans cet article, nous présentons une approche basée sur l'apprentissage en profondeur pour la coloration histochimique virtuelle sans étiquette d'images de télédétection photoacoustique à absorption totale (TA-PARS) de tissus non colorés. TA-PARS fournit une gamme de contrastes sans étiquette directement mesurés tels que la diffusion et l'absorption totale (radiative et non radiative), idéale pour développer des colorisations H&E sans avoir besoin de déduire des structures tissulaires arbitraires. Nous utilisons un réseau contradictoire génératif Pix2Pix pour développer des visualisations analogues à la coloration H&E à partir d'images TA-PARS sans étiquette. Des sections minces de tissu cutané humain ont d'abord été colorées virtuellement avec le TA-PARS, puis ont été colorées chimiquement avec H&E produisant une comparaison un à un entre la coloration virtuelle et chimique. Les images colorées virtuellement et chimiquement assorties présentent une concordance élevée validant la colorisation numérique des images TA-PARS par rapport à l'étalon-or H&E. Les images TA-PARS ont été examinées par quatre dermatologues pathologistes qui ont confirmé qu'elles étaient de qualité diagnostique et que la résolution, le contraste et la couleur permettaient une interprétation comme s'il s'agissait de H&E. L'approche présentée ouvre la voie au développement de l'imagerie histologique sans glissière TA-PARS, qui promet de réduire considérablement le temps entre la résection de l'échantillon et l'imagerie histologique.

L'histopathologie est l'outil d'examen microscopique fondamental dans de nombreux domaines, notamment le diagnostic et le pronostic du cancer, l'oncologie chirurgicale et la découverte et le développement de médicaments1. La coloration des tissus pour l'imagerie microscopique a permis l'histopathologie en aidant à distinguer la composition des échantillons de tissus. L'étalon-or de l'imagerie histologique est la microscopie à fond clair de préparations de tissus minces colorés au formol fixé en paraffine (FFPE), où l'ensemble de coloration le plus courant est l'hématoxyline et l'éosine (H&E). L'hématoxyline colore les noyaux cellulaires avec un bleu-violet foncé, tandis que l'éosine colore le cytoplasme et la matrice extracellulaire avec des nuances roses2.

Le développement de ces échantillons FFPE colorés pour l'évaluation microscopique en fond clair repose sur un processus laborieux de fixation, d'enrobage, de sectionnement et de coloration3, une procédure qui prend plusieurs jours à compléter4. Ce long processus a motivé l'adoption de l'histologie par coupe congelée (FS), une technique couramment utilisée pour une évaluation peropératoire rapide. FS permet des délais d'exécution d'environ 20 min5. Cependant, l'échantillonnage d'échantillons pour FS est limité et implique des processus techniques difficiles. La congélation rapide introduit des artefacts détériorant la morphologie cellulaire, ce qui affecte à son tour le diagnostic pathologique des échantillons de tissus par les pathologistes5. En raison de ces limitations, les procédures histochimiques FFPE restent la méthode de référence irremplaçable.

La coloration histochimique retarde non seulement l'évaluation de l'échantillon, mais les étapes de préparation de l'échantillon modifient de façon permanente la composition des tissus avec plusieurs substances chimiques, ce qui signifie que les tissus ne peuvent être colorés qu'une seule fois par section2. Une lame indépendante doit être préparée pour chaque contraste de coloration souhaité. Cette préparation intensive de tissus FFPE peut retarder les diagnostics de cancer et les évaluations des marges de plus d'une semaine, ce qui retarde à son tour le traitement d'appoint et les procédures supplémentaires. Cela motive une technique cliniquement acceptable pour fournir des images de type histologie précises, rapides et reproductibles sans étiquette.

Étant donné que les pathologistes sont principalement formés pour poser des diagnostics sur des échantillons de tissus colorés par histochimie, une approche prometteuse consiste à développer des algorithmes qui génèrent des visualisations virtuelles de type H&E de tissus non marqués, simulant les effets de coloration chimique. Cela facilitera l'adoption d'outils sans étiquette. De plus, la coloration virtuelle préserve les tissus, permettant le traitement en aval des mêmes coupes de tissus. Dans un cadre clinique, cela améliorerait l'utilité diagnostique des petits échantillons de tissus. De plus, les colorations virtuelles, en éliminant la variabilité pré-analytique, devraient réduire la variabilité de coloration inter et intra-laboratoire causée par de légères variations de processus, répondant ainsi à un défi majeur en pathologie clinique. Enfin, la reproduction directe de la coloration actuelle permet une validation individuelle par rapport au vrai H&E, une étape nécessaire à l'adoption.

Plusieurs microscopes optiques ont été développés pour fournir des capacités d'imagerie de type H&E, telles que l'imagerie de phase quantitative6, la microscopie confocale à réflexion (RCM)7, la microscopie avec excitation de surface ultraviolette (MUSE)8,9, la tomographie par cohérence optique (OCT)10,11, 12, microscopie à autofluorescence13 et microscopie photoacoustique (PAM)14,15,16,17. Ces méthodes sont généralement couplées à des modèles de coloration virtuelle basés sur l'apprentissage en profondeur, en particulier les réseaux antagonistes génératifs (GAN)18. Des images microscopiques sont capturées puis utilisées pour entraîner un réseau à effectuer une coloration H&E virtuelle. Par conséquent, la qualité de la coloration H&E virtuelle résultante sera directement déterminée par les caractéristiques du microscope optique utilisé pour capturer les images. Dans le cas idéal, la technique de microscopie (1) fonctionnerait en mode réflexion, permettant l'imagerie d'échantillons de tissus épais, et (2) fournirait un contraste analogue à la coloration histochimique actuelle, améliorant la qualité de la colorisation artificielle en évitant les inférences de caractéristiques diagnostiques essentielles. D'autres microscopes optiques qui ont montré des progrès remarquables dans l'imagerie de type H&E comprennent la microscopie à feuille de lumière (LSM)19 et la miscoscopie à diffusion Raman stimulée (SRS)20,21.

Parmi les techniques répertoriées, MUSE et LSM ont démontré un accord acceptable avec l'histologie colorée H&E, imitant la spécificité de coloration H&E standard. Cependant, MUSE et LSM s'appuient sur des colorants de fluorescence pour fournir un contraste H&E. Ces colorants peuvent être potentiellement mutagènes, cancérigènes ou toxiques, ce qui entrave l'applicabilité in situ de ces techniques basées sur la fluorescence9. De plus, le LSM nécessite des échantillons relativement clairs pour l'imagerie volumétrique 3D de tissus frais, ce qui nécessite un équipement supplémentaire et de longs temps de prétraitement, ce qui rend la technique peu pratique dans un contexte peropératoire19. En conséquence, les techniques sans étiquette sont opportunes.

Une modalité sans étiquette populaire, SRS, exploite la résonance vibrationnelle des liaisons moléculaires pour fournir un contraste22. Le SRS a démontré des résultats prometteurs par rapport aux colorations H&E dans des échantillons de tissus minces et épais. Cependant, le SRS fonctionne généralement en mode transmission21,22,23. Les tissus épais sont généralement compressés à des épaisseurs transmissibles pour acquérir des images20, ce qui modifie gravement la morphologie des tissus. Cela affecte non seulement l'évaluation du pathologiste, mais rend également le SRS peu pratique pour l'imagerie in situ.

À l'inverse, l'OCT fonctionne généralement en mode réflexion et convient bien à l'imagerie d'échantillons de tissus épais. L'OCT a montré un potentiel dans l'imagerie de bloc de tissu sans étiquette11,24, l'évaluation de la marge chirurgicale25,26 et l'examen de biopsie27,28. Cependant, l'OCT utilise un contraste de diffusion optique qui met en évidence des informations principalement morphologiques. Ce contraste n'a pas la spécificité suffisante pour distinguer les biomolécules comme les noyaux cellulaires et le cytoplasme, ce qui est essentiel pour l'analyse histologique. Par la suite, les méthodes de colorisation artificielle doivent déduire les structures de ces caractéristiques diagnostiques essentielles, ce qui réduit considérablement la confiance diagnostique. Cela motive l'adoption d'une modalité de microscopie sans étiquette avec une spécificité de chromophore plus élevée, ce qui peut améliorer la confiance de la colorisation.

Récemment, la microscopie à autofluorescence est devenue un concurrent populaire pour l'histologie virtuelle. L'autofluorescence fournit des visualisations sans étiquette de biomolécules telles que l'élastine, le collagène, les acides aminés, le NADPH et d'autres organites cellulaires, à des longueurs d'onde d'excitation allant de l'UV à ~ 500 nm29. Auparavant, Rivenson et al.13 avaient réussi à développer une coloration H&E virtuelle à partir d'images d'autofluorescence. Dans ce travail, un réseau de neurones profonds a été entraîné sur des paires d'images autofluorescentes et colorées H&E dans le but de la colorisation. Cette méthode a été appliquée avec succès aux images d'autofluorescence, en contournant le processus de coloration H&E. Cependant, la large réalisation de cette technique dans les tissus en vrac a été limitée par le contraste d'autofluorescence. Bien que l'autofluorescence mette en évidence un certain nombre de biomolécules ressemblant à la coloration à l'éosine, l'ADN et les noyaux30 ne présentent aucune autofluorescence mesurable31. Par conséquent, alors que de nombreux éléments de diagnostic sont présents, le réseau de colorisation doit estimer les caractéristiques nucléaires car elles ne peuvent pas être mesurées. L'inférence des structures nucléaires (un déterminant clé du diagnostic du cancer) présente des défis pour l'adoption clinique et l'approbation réglementaire.

Une modalité, PAM est apparue comme une puissante modalité de microscopie sans étiquette, offrant un contraste sélectif de biomolécules d'un large éventail de chromophores. PAM permet une discrimination précise en utilisant des longueurs d'onde d'excitation spécifiques pour cibler les caractéristiques d'absorption optique des chromophores individuels. Auparavant, il a été démontré que les systèmes PAM récupéraient à la fois des visualisations nucléaires analogues à la coloration à l'hématoxyline32,33 et une imagerie du tissu conjonctif analogue à la coloration à l'éosine15. Cependant, les systèmes PAM traditionnels présentent un inconvénient majeur. PAM est une modalité d'imagerie optoacoustique hybride, où les pressions photoacoustiques induites par l'absorption optique sont capturées sous forme de signaux ultrasonores. La mesure de ces ondes de pression acoustique nécessite un transducteur à ultrasons couplé acoustiquement. La nécessité d'un couplage acoustique efficace signifie que le transducteur doit être en contact avec l'échantillon ou immergé dans un milieu de couplage tel qu'un réservoir d'eau14,15,16. Cette disposition entrave l'adéquation de PAM pour plusieurs applications cliniques.

Une modalité nouvellement développée, la télédétection photoacoustique (PARS)34,35,36, surmonte les inconvénients du PAM. Dans le PARS, le transducteur à ultrasons à couplage acoustique est remplacé par un laser de détection secondaire co-focalisé, offrant une imagerie photoacoustique sans étiquette tout-optique robuste et sans contact37. Au cours des dernières années, le PARS est devenu un puissant concurrent dans le domaine de l'imagerie histologique sans étiquette34,35,36,38. PARS peut émuler la coloration histochimique actuelle, en ciblant l'absorption UV de l'ADN (analogue à la coloration à l'hématoxyline)34,35, et en ciblant l'absorption à 420 nm des cytochromes (analogue à la coloration à l'hématoxyline)34. Des travaux récents ont montré que le PARS peut offrir un contraste élevé et une résolution spatiale élevée dans les tissus fraîchement réséqués, les tissus fixés au formol et les coupes de tissus FFPE35,36. Dans les tissus réséqués, il a même été démontré que le PARS fournit une imagerie 3D des noyaux sous la surface35.

Dans cet article, nous utilisons une architecture PARS de deuxième génération, la télédétection photoacoustique à absorption totale (TA-PARS)36, pour fournir des images de type histologie sans étiquette. Comme indiqué par Ecclestone et al.36, l'architecture TA-PARS intègre un certain nombre d'avancées offrant une sensibilité et un contraste améliorés lors de l'imagerie dans des échantillons de tissus. Appliqué aux tissus réséqués, TA-PARS mesure directement le contraste analogue à la coloration H&E, capturant les noyaux et le cytoplasme indépendamment. Étant donné que le cadre proposé mesure directement les informations H&E, il permet une modélisation de colorisation fiable. De plus, cela offre la possibilité d'une comparaison directe avec la coloration H&E de vérité terrain tout en fournissant des résultats acceptables pour les applications cliniques.

Le TA-PARS fonctionne en introduisant une impulsion de lumière d'excitation ciblée sur un chromophore, puis en capturant les processus de relaxation lorsque le chromophore libère l'énergie optique absorbée. Il existe deux voies principales pour cette relaxation : radiative et non radiative. Pendant la relaxation non radiative, l'énergie optique absorbée est dissipée sous forme de chaleur. Cela génère une dilatation thermoélastique locale et des pressions photoacoustiques lorsque le processus d'excitation est suffisamment rapide37. La relaxation non radiative induit des modulations dans les propriétés optiques locales, qui sont capturées sous forme de fluctuations d'intensité rétro-réfléchies dans un laser de détection TA-PARS co-focalisé. Lors de l'utilisation d'une excitation à 266 nm, l'absorption non radiative révèle des structures principalement nucléaires, généralement visualisées par la coloration "H". A l'inverse, lors de la relaxation radiative, l'énergie absorbée est émise sous forme de photons. La relaxation radiative est capturée comme ces émissions optiques induites par l'absorption, le même mécanisme que l'imagerie par fluorescence. Lors de l'utilisation d'une excitation à 266 nm, le contraste d'absorption radiative représente généralement des caractéristiques extranucléaires, généralement révélées par la coloration "E". En plus des fractions d'absorption optique, la diffusion locale est également capturée à l'aide du laser de détection TA-PARS. La diffusion optique révèle les structures morphologiques dans des coupes de tissus minces38.

Au total, la microscopie TA-PARS fournit simultanément une imagerie sans contact sans étiquette des contrastes d'absorption radiative, d'absorption non radiative et de diffusion optique. Dans la mesure de nos connaissances, le TA-PARS est la seule modalité qui peut fournir les trois mécanismes de contraste en une seule capture. Ce riche éventail de données d'entrée permet une récupération simultanée des structures, y compris les noyaux cellulaires, la fibrine, les tissus conjonctifs, les adipocytes et les neurones36 en un seul événement d'excitation. La confiance diagnostique de la coloration histologique virtuelle basée sur l'apprentissage en profondeur peut être améliorée en utilisant cet ensemble de données plus informatif pour la formation et la colorisation du réseau.

Ici, nous utilisons un modèle de traduction d'image à image à usage général, à savoir Pix2Pix39, pour coloriser les images histologiques capturées par le système TA-PARS. Le modèle Pix2Pix est conçu sur la base de réseaux antagonistes génératifs (GAN)18, un type de modèle génératif qui crée de nouveaux ensembles de données sur la base de données d'entrée (formation) données. L'architecture est composée d'un sous-réseau générateur pour créer de nouvelles données réalisables et d'un sous-réseau discriminateur qui tente de faire la distinction entre les données nouvellement générées (synthétiques) et les données de vérité terrain (réelles). Les deux sous-réseaux sont formés simultanément dans un processus contradictoire, où le modèle générateur vise à maximiser le taux d'erreur du modèle discriminateur, tandis que le modèle discriminateur tente de minimiser l'erreur de classification. Pour la tâche de formation, le réseau a été alimenté par des images à contrastes multiples des canaux TA-PARS co-enregistrés avec des images H&E qui ont été capturées à l'aide de procédures d'imagerie de diapositives traditionnelles.

Grâce à la gamme de contrastes fournie par TA-PARS, nous capturons directement les informations H&E. La mesure directe du contraste H&E souhaité dans un ensemble de données permet un modèle d'apprentissage en profondeur solide, évitant les hypothèses ou les inférences non fondées sur la présence de caractéristiques telles que les noyaux cellulaires. Le travail proposé fournit des TA-PARS de type H&E de lames de tissus, conduisant à des images comparables à l'étalon-or. Les images d'histologie virtuelles TA-PARS ont été examinées par quatre pathologistes dermatologiques qui ont confirmé qu'elles étaient de qualité diagnostique et que la résolution, le contraste et la couleur permettaient une interprétation comme si elles étaient H&E. Il s'agit d'une étape essentielle vers le développement d'un flux de travail histopathologique alternatif avec une coloration virtuelle sans lame d'échantillons de tissus frais. En fin de compte, la réalisation d'une imagerie in situ de type histologique permettrait une évaluation des marges peropératoires en temps quasi réel.

L'ensemble de données utilisé dans cette étude a été recueilli à partir de fines coupes de tissus cutanés humains fixés à la paraffine fixée au formol (FFPE). Des échantillons de tissus anonymes ont été fournis par des collaborateurs cliniques du Cross-Cancer Institute (Edmonton, Alberta, Canada). Ces échantillons ont été prélevés selon des protocoles approuvés par le Research Ethics Board of Alberta (Protocole ID : HREBA.CC-18-0277) et le Comité d'éthique de la recherche en santé de l'Université de Waterloo (Photoacoustic Remote Sensing (PARS) Microscopy of Surgical Resection, Needle Biopsy, et échantillons de pathologie ; ID de protocole : 40275). Le consentement du patient a été annulé par le comité d'éthique car les échantillons sont des tissus d'archives qui ne sont plus nécessaires pour le diagnostic des patients, et aucune information n'a été fournie aux chercheurs sur l'identité du patient. Toutes les expériences impliquant des tissus humains ont été menées conformément aux lignes directrices et aux règlements du gouvernement du Canada, tels que « Éthique de la recherche avec des êtres humains (EPTC 2) ».

L'ensemble de données des paires TA-PARS et H&E co-enregistrées requises pour la procédure de coloration virtuelle a été acquis comme suit. Des sections de tissus minces non colorées ont été imagées avec le système TA-PARS. Une fois imagés, les spécimens ont été colorés et scannés avec un microscope à fond clair pour générer des paires d'images TA-PARS et H&E appariées des mêmes échantillons. La procédure de préparation du jeu de données est illustrée à la Fig. 1.

Processus de préparation des ensembles de données TA-PARS et H&E d'images de diapositives de tissus cutanés humains. Barre d'échelle : 50 µm.

Les coupes de tissu non colorées ont été préparées comme suit. Tout d'abord, les tissus réséqués en vrac ont été fixés dans une solution de fixation au formol (dans les 20 minutes suivant la résection) pendant 48 heures maximum. Les tissus ont ensuite été déshydratés et préparés pour la pénétration de cire de paraffine. Au cours de ce processus, les tissus ont été débarrassés des graisses résiduelles. Ensuite, les tissus ont été intégrés dans le substrat de paraffine créant des blocs de tissus FFPE. Des sections minces d'environ 5 µm d'épaisseur ont été tranchées à partir de la surface du bloc de tissu FFPE. Des lames minces ont été fixées directement sur des lames de verre et l'excès de paraffine a été éliminé en cuisant la lame à 60°C pendant 60 min. À la fin de ce processus, les sections minces étaient prêtes pour l'imagerie avec le système TA-PARS. Toutes les images ont été réalisées au PhotoMedicine Labs de l'Université de Waterloo. Une fois l'ensemble de données TA-PARS collecté, les lames de tissu minces ont été colorées avec H&E, recouvertes d'un milieu de montage et d'une lamelle, puis imagées à l'aide d'un microscope à fond clair en mode transmission, fournissant l'ensemble de données H&E correspondant.

Une description plus détaillée de l'architecture du système TA-PARS et du processus de formation d'image peut être trouvée dans36. Brièvement, le système expérimental est illustré sur la figure 2. La source d'excitation était une diode laser à 266 nm (Wedge XF 266, RPMC). La détection était un laser OBIS-LS de 405 nm (OBIS LS 405, Coherent). Les images ont été capturées avec des énergies d'impulsion d'excitation d'environ 400 pJ et des niveaux de puissance de détection d'environ 0,16 mW36. Les sources d'excitation et de détection ont été combinées via un miroir dichroïque (Fig. 2 : DM), puis co-focalisées sur l'échantillon avec une lentille d'objectif UV 0,42 NA (Fig. 2 : OL), offrant une résolution spatiale maximale d'environ 350 nm36. La lumière de détection revenant de l'échantillon (contenant la diffusion optique et la relaxation non radiative) a été couplée par fibre dans le circulateur (Fig. 2 : Circ.), qui a ensuite redirigé la lumière réfléchie vers une photodiode (Fig. 2 : PD) où les modulations d'intensité photoacoustique à l'échelle nanoseconde ont été capturées. Parallèlement, la relaxation radiative a été isolée chromatiquement puis capturée à l'aide d'une photodiode.

Architecture et configuration du système TA-PARS simplifiées. Les étiquettes des composants sont les suivantes : miroir dichroïque (DM), expanseur de faisceau variable (VBE), collimateur (Col.), circulateur (Circ.), filtre spectral (SF), lentille de condenseur (Cond.), photodiode (PD), 10 :90 diviseur (90:10), miroir (M) et objectif (OL).

La formation d'image TA-PARS est conduite comme suit. Pour former une image, les platines mécaniques ont été utilisées pour balayer l'échantillon tandis que l'objectif restait fixe. La vitesse des étages a été ajustée pour obtenir une taille de pixel de 250 nm. La source d'excitation pulsée à 50 kHz a été utilisée pour exciter le tissu, et les signaux induits dus à la diffusion optique, à la relaxation radiative et non radiative ont été collectés à chaque impulsion. Chaque événement a été placé dans le canal qui correspond à son signal. Ces signaux ont été compressés en extrayant une seule caractéristique qui devient la valeur du pixel. Par conséquent, les images sont collectées un pixel à la fois de sorte que la vitesse d'imagerie totale est largement déterminée par le taux de répétition des lasers d'excitation. L'excitation de 50 kHz utilisée ici fournit une vitesse d'imagerie d'environ 25 s par mégapixel. Les images finales sont ensuite reconstruites pour chaque canal TA-PARS en ajustant les valeurs de pixel calculées à une grille cartésienne en fonction de leurs signaux de position correspondants provenant des étages. Les images ont ensuite été traitées en fonction de la tâche d'intérêt. Dans la sous-section suivante, le traitement des images pour la tâche de coloration virtuelle est décrit.

Dans ce travail, un modèle Pix2Pix GAN39 a été adopté. Le modèle nécessite des correspondances pixel à pixel entre les données d'entrée (TA-PARS) et la vérité terrain (H&E), où l'objectif est d'apprendre une transformation statistique entre les deux domaines de données. Étant donné que les images TA-PARS et H&E ont été acquises à l'aide de techniques différentes, les images du même échantillon n'ont pas été co-enregistrées. Par conséquent, un prétraitement, y compris l'appariement du champ de vision et l'enregistrement, était nécessaire pour produire des paires approximativement co-enregistrées d'images TA-PARS et H&E. Le cadre de coloration virtuelle est illustré à la Fig. 3.

Cadre de coloration virtuelle. Des paires d'images TA-PARS et H&E sont co-enregistrées pour créer l'ensemble de données de formation, qui est ensuite utilisé pour former le modèle Pix2Pix39. Les images TA-PARS invisibles sont ensuite introduites dans le modèle formé pour la coloration virtuelle, produisant des visualisations de type H&E. Barre d'échelle : 50 µm.

Le processus d'enregistrement peut être décrit comme suit. Tout d'abord, les champs de vision correspondants (FOV) des deux domaines d'image ont été extraits des images de diapositives entières et grossièrement appariés en termes de taille de pixel en préparation du processus d'enregistrement un à un. Pour l'enregistrement, l'outil d'enregistrement des points de contrôle a été déployé à partir de MATLAB Image Processing Toolbox. Les images TA-PARS ont été choisies comme images de référence, et H&E comme images à enregistrer. Les points de contrôle ont été sélectionnés manuellement puis affinés dans un deuxième passage pour minimiser les distorsions globales et locales. Ensuite, l'algorithme ajuste une transformation géométrique non rigide40 entre les deux images, qui a été appliquée aux images H&E pour obtenir des images TA-PARS et H&E co-enregistrées. Étant donné que tous les canaux TA-PARS étaient intrinsèquement enregistrés, l'ensemble du processus d'enregistrement a été appliqué en utilisant uniquement le canal non radiatif.

Une fois le processus d'enregistrement terminé, l'ensemble de données était prêt pour la formation du réseau pour la colorisation. Dans cette étude, les trois canaux TA-PARS ont été utilisés pour former le modèle. La figure 4 illustre les entrées et la sortie du réseau. Les canaux d'absorption et de diffusion optique non radiatifs et radiatifs sont représentés respectivement sur les figures 4a à c. L'entrée multicanal est représentée sur la figure 4d comme la concaténation des trois canaux. Un exemple de colorisation est illustré à la Fig. 4e et la vérité terrain H&E correspondante est illustrée à la Fig. 4f. Il est clair que le canal d'absorption non radiative présente un fort contraste nucléaire représentant le contraste d'hématoxyline, tandis que le contraste d'absorption radiative présente le contraste d'éosine montrant les informations morphologiques des tissus. Les images TA-PARS normalisées subissent un étirement du contraste en saturant les 1 % supérieurs et les 1 % inférieurs de toutes les valeurs de pixels, puis ont été inversées en couleur pour correspondre à la palette de couleurs et à la distribution de l'histogramme des images de vérité terrain en niveaux de gris. Plusieurs ensembles de données ont été préparés de la même manière pour la validation du concept.

Le réseau de colorisation des images d'entrée et de sortie du tissu cutané humain glisse. ( a ) Image de contraste d'absorption non radiative TA-PARS capturée à l'aide d'un microscope TA-PARS. ( b ) Contraste d'absorption radiative TA-PARS du même tissu en utilisant le même microscope. ( c ) Contraste de diffusion optique TA-PARS. (d) Image TA-PARS des trois canaux (entrée réseau à colorier). (e) Image TA-PARS colorisée à l'aide du modèle Pix2Pix. ( f ) Tissu histologiquement coloré de la même région pris sur un microscope à fond clair, la vérité fondamentale pour le cadre de coloration virtuelle. Barre d'échelle : 100 µm.

Ce cadre est destiné à remplacer le processus de coloration histologique, où le modèle Pix2Pix a été formé en utilisant les images TA-PARS multicanaux comme entrées et les images H&E correspondantes comme étiquettes, et le réseau a été formé pour apprendre la fonction de transformation statistique entre les deux domaines . Une fois le modèle formé, le processus de coloration virtuelle prend quelques secondes pour produire une version virtuellement colorée d'une image de 4000 × 6500 pixels (~ 1,6 mm2).

Un modèle de traduction d'image à image Pix2Pix39 a été appliqué pour transformer les images TA-PARS sans étiquette en images colorées virtuellement qui correspondent à leurs échantillons colorés histochimiques H&E correspondants. Le modèle est basé sur une architecture GAN, ou plus précisément GAN conditionnel (cGAN)41, où le modèle génératif est en outre conditionné sur les données d'entrée.

L'algorithme de formation de modèle dans Pix2Pix forme simultanément deux réseaux de neurones distincts, le générateur et le discriminateur, comme illustré à la Fig. 5. L'algorithme de formation apprend à minimiser une fonction de perte entre la sortie du réseau et la vérité terrain. Le réseau discriminateur est formé pour différencier efficacement les images réelles et générées synthétiquement, tandis que le réseau générateur est formé en même temps pour produire des images qui ressemblent mieux aux données de vérité terrain, ce qui rend progressivement plus difficile pour le discriminateur de se différencier correctement. En conséquence, le modèle est capable de produire des images TA-PARS colorées virtuellement d'une qualité diagnostique comparable aux images colorées histologiquement.

Une illustration de l'algorithme d'entraînement Pix2Pix. Pix2Pix est composé de deux sous-réseaux : le discriminateur et le générateur. Le sous-réseau discriminateur est formé pour faire la distinction entre les H&E réels et les H&E générés synthétiquement. Simultanément, le sous-réseau du générateur est formé pour confondre le discriminateur en produisant des images qui ressemblent à de vrais H&E.

La formation pour le modèle standard Pix2Pix a été réalisée à l'aide d'images couleur RVB à 3 canaux. Dans l'approche proposée, les trois canaux ont été remplacés par le contraste d'absorption non radiatif, le contraste d'absorption radiatif et la diffusion optique, respectivement. De cette manière, le modèle peut apprendre simultanément des informations complémentaires à partir des trois sources d'informations disponibles.

Des patchs superposés de 256 × 256 pixels ont été extraits des images TA-PARS et H&E pour générer les ensembles d'apprentissage et de validation. Environ 15 000 correctifs d'entraînement et 6 000 correctifs de validation ont été utilisés dans les expériences. Le nombre maximum d'époques a été fixé à 500 avec un critère d'arrêt précoce pour mettre fin à l'entraînement lorsque la perte du générateur cesse de s'améliorer. Le modèle formé a ensuite été appliqué aux images de test qui ont également été subdivisées en patchs superposés de 256 × 256 pixels. Un chevauchement d'environ 50 % était généralement suffisant pour éviter les artefacts visibles aux bords des patchs adjacents dans l'image finale cousue. L'algorithme de colorisation a été implémenté dans Python version 3.8.10 et la formation du modèle a été implémentée à l'aide de PyTorch version 1.9.1 avec prise en charge de CUDA version 11.

Neuf images représentatives de TA-PARS générées et de peau humaine colorisée par IA ont été distribuées à quatre dermatopathologistes certifiés pour évaluation. Aucun des dermatopathologistes n'avait de conflits d'intérêts ou de relations financières liés à cette technologie. Chaque pathologiste a confirmé que toutes les images sont de qualité suffisante pour permettre le diagnostic, et que la qualité du contraste, de la résolution et de la colorisation est suffisamment H&E pour permettre des diagnostics cliniques.

Nous avons appliqué notre cadre d'apprentissage automatique à des coupes de tissus cutanés humains non colorés imagés avec TA-PARS. Ces résultats ont été comparés à des images de microscopie à fond clair, qui ont été acquises après coloration exacte des mêmes tissus avec H&E. Par conséquent, ces images fournissent une correspondance un à un noyau à noyau entre le TA-PARS et les images H&E correspondantes. Compte tenu des ensembles de données limités, notre première étape consistait à effectuer une preuve de concept et à encadrer les performances du modèle par surajustement. Lors du surajustement, les mêmes données ont été utilisées pour la formation et le test du modèle. Cela a été réalisé en utilisant une seule image, divisée en 5000 patchs de 256 × 256 pixels chacun. Les résultats de colorisation de cette expérience sont visuellement presque impossibles à distinguer des images de vérité terrain (comme illustré à la Fig. 6), ce qui fixe une limite supérieure aux performances du modèle. Lors de la généralisation du modèle, des résultats comparables peuvent être obtenus de manière réaliste avec des données non incluses dans l'ensemble de données d'apprentissage (données invisibles) si l'ensemble d'apprentissage couvre suffisamment la variabilité du domaine cible.

Coloration virtuelle d'images TA-PARS de lames de tissus cutanés humains. Ici, les mêmes images ont été utilisées pour former et tester le modèle, fixant une limite supérieure aux performances du modèle. Barre d'échelle : 100 µm.

Avec la conceptualisation initiale du processus de colorisation examinée à travers le traitement des données surajustées, l'étape suivante était la généralisation. Par conséquent, nous avons élargi nos expériences pour évaluer les performances de généralisation du modèle. Environ 15 000 correctifs d'entraînement et 6 000 correctifs de validation ont été utilisés dans l'expérience. Le modèle a été testé exclusivement sur des images TA-PARS invisibles, qui ont été prises à partir des mêmes coupes de tissus sans étiquette. Encore une fois, les résultats montrent un fort accord visuel entre la coloration virtuelle TA-PARS et la vérité terrain H&E, où la colorisation des différentes structures tissulaires ressemble à ce que l'on voit habituellement dans les échantillons de tissus colorés H&E. Plus précisément, les noyaux sont intéressants dans les tissus représentés sur la figure 7. Dans de nombreuses tumeurs malignes, la morphologie et la distribution des noyaux individuels peuvent être révélatrices de la progression et de la gravité de la maladie. Par conséquent, la représentation précise des structures nucléaires est primordiale pour toute technique de coloration virtuelle. Comme le montre la figure 7, il existe une grande acuité dans la réplication de la forme et de la taille des noyaux entre le TA-PARS colorisé et le vrai H&E. En évaluant la section améliorée de la Fig. 7a, la ressemblance est encore plus apparente car les structures nucléaires sont très similaires entre le H&E et la coloration virtuelle.

Résultats de coloration virtuelle de différentes parties du tissu cutané humain à l'aide de données invisibles. (a) Image agrandie du tissu conjonctif. Barre d'échelle 25 µm. (b) Image d'un tissu conjonctif dense et irrégulier. Barre d'échelle 100 µm. (i) TA-PAR brut. (ii) TA-PARS de type H&E. (iii) Vrai H&E. Les ensembles d'images (a) et (b) représentent un accord visuel élevé, en particulier des structures nucléaires, entre le H&E et la coloration virtuelle.

En plus de la concordance visuelle, deux mesures statistiques ont été utilisées à des fins de comparaison, la mesure de l'indice de similarité structurelle (SSIM)42 et l'erreur quadratique moyenne (RMSE). Les images colorisées et de vérité terrain ont été converties dans l'espace colorimétrique Lab avant les calculs SSIM et RMSE pour représenter les images dans un espace colorimétrique perceptuellement corrélé. Le RMSE a été choisi pour fournir une comparaison directe entre les images, capturant les vraies différences entre la tache virtuelle et le H&E. Le SSIM a été sélectionné comme métrique car il mesure le changement perçu dans les informations structurelles ainsi que les changements de contraste et de luminance, plutôt que les erreurs absolues, imitant le système visuel humain42. Cette métrique (SSIM) est particulièrement intéressante en raison de la nature subjective de l'évaluation de l'histopathologie43. Les métriques statistiques ont été appliquées sur 1000 patchs de taille 256 × 256 pixels. Le SSIM calculé moyen était de 0,91 ± 0,02 tandis qu'un RMSE moyen de 14,28 ± 1,61 a été mesuré, indiquant un accord structurel et quantitatif objectif entre le TA-PARS de type H&E et le vrai H&E.

En évaluant des sections de tissu cutané supplémentaires et plus grandes (Fig. 8), une comparaison supplémentaire peut être établie entre les caractéristiques diagnostiques du TA-PARS et les images H&E. Ces images capturent le derme du tissu cutané humain contenant principalement du tissu conjonctif et des vaisseaux sanguins. En observant directement les données brutes TA-PARS (Fig. 8-i), les structures nucléaires sont discernables dans le bleu foncé/violet, tandis que les tissus conjonctifs sont visibles dans les tons de jaune et d'orange. Enfin, la microvascularisation est nettement visible en rouge. Certains détails tels que le système vasculaire et les noyaux peuvent être plus faciles à identifier et à évaluer dans l'entrée TA-PARS brute (Fig. 8-i) par rapport au H&E (Fig. 8-iii) ou aux images virtuellement colorées (Fig. 8-ii). Toutes les informations de diagnostic nécessaires à un pathologiste pour effectuer un diagnostic et une analyse histologique peuvent être présentes dans les images TA-PARS brutes. Cependant, les manifestations TA-PARS sont colorées de manière significativement différente des images H&E de référence. Ici, les trois contrastes TA-PARS (contraste d'absorption non radiatif et radiatif et diffusion optique) sont présentés directement comme les canaux de couleur rouge, vert et bleu formant une image combinée (le même format fourni au réseau GAN). Les pathologistes actuels ont une formation approfondie et des compétences en reconnaissance de formes basées principalement sur l'imagerie H&E. Par conséquent, un recyclage substantiel serait nécessaire pour que les pathologistes interprètent les différentes couleurs des images TA-PARS brutes. Auparavant, il a été démontré que ces visualisations TA-PARS pouvaient être coloriées pour développer des visualisations de type H&E36. Cependant, la technique peut ne pas être facilement généralisée à une gamme de tissus. Cela motive la technique de colorisation AI proposée, qui peut permettre l'acceptation clinique en transformant les images TA-PARS en un format cliniquement accepté.

Un autre ensemble de résultats de coloration virtuelle utilisant des données inédites de tissu cutané humain. Les ensembles d'images (a) et (b) montrent différentes parties du derme comme le tissu conjonctif et les vaisseaux sanguins. (i) TA-PAR brut. (ii) TA-PARS de type H&E. (iii) Vrai H&E. Barre d'échelle 100 µm.

Avec le H&E virtuel TA-PARS, les tissus conjonctifs sous-cutanés riches en collagène et les structures nucléaires sont représentés avec une qualité et un contraste élevés, effectivement comparables à l'imagerie de référence. De plus, quatre dermatopathologistes indépendants ont évalué les images et confirmé que la colorisation, le contraste et la résolution sont suffisants pour le diagnostic clinique et subjectivement équivalents à l'imagerie H&E. Il s'agit d'une conclusion encourageante car ces images TA-PARS ont été produites directement à partir d'échantillons de tissus non colorés. De plus, cela confirme qu'un modèle robuste a été développé qui peut être généralisé pour colorer différentes lames entières de tissus cutanés avec une coloration H&E. Le modèle s'est avéré capable de s'adapter aux variations des conditions d'imagerie présentes entre différents spécimens, telles que les différences de luminosité de l'image.

À l'avenir, des types de tissus supplémentaires peuvent être explorés avec le TA-PARS. La coloration virtuelle des différents types de tissus peut nécessiter un réglage spécifique du réseau GAN. Chaque type de tissu (par exemple, sein, cerveau, peau) peut présenter certaines teintes H&E uniques. Par la suite, le modèle actuel qui est optimisé pour les tissus cutanés peut ne pas être parfait pour d'autres tissus. Bien qu'il puisse fournir d'excellentes visualisations de type H&E, certaines teintes peuvent être différentes lorsqu'elles sont appliquées à d'autres variétés de tissus. Cela correspond aux pratiques cliniques actuelles, car différents types de tissus sont souvent traités de manière légèrement différente dans les flux de travail histopathologiques actuels44. Les pratiques de coloration sont généralement ajustées "à la volée" en fonction du type de tissu. Ces modifications sont un contributeur majeur à la variabilité de la coloration H&E mise en évidence dans le manuscrit. Par conséquent, pour fournir une colorisation optimale, les pathologistes peuvent avoir besoin de fournir le type de tissu (p. ex., peau, cerveau, sein) avant la colorisation. À l'avenir, les travaux futurs se concentreront sur le développement de plusieurs modèles de colorisation pour d'autres types de tissus individuels comme le cerveau et le sein, ainsi que différentes taches.

Bien que l'étude actuelle ait été limitée à des coupes de tissus afin d'avoir une correspondance biunivoque avec H&E du même tissu, la microscopie TA-PARS fournit également des images haute résolution de tissus fraîchement réséqués36. La capture directe des contrastes d'hématoxyline et d'éosine peut potentiellement permettre une colorisation comparable des tissus frais. Dans un futur proche, des études cliniques formalisées seront menées visant à valider et comparer le H&E virtuel TA-PARS aux visualisations traditionnelles. Une fois cette validation terminée prouvant l'exactitude des colorisations, le système proposé peut être utilisé directement dans des échantillons de tissus réséqués en vrac. Lors du déplacement vers des tissus en vrac, l'imagerie TA-PARS offre d'autres avantages potentiels par rapport à la norme H&E. Outre le temps de diagnostic nettement réduit, cette technique, lorsqu'elle est appliquée sur des tissus frais, supprime de nombreuses variables pré-analytiques telles que le temps écoulé depuis la dévitalisation, le temps entre la dévitalisation et la fixation, le temps de fixation, la variabilité de la fixation en fonction de la distance du la surface et la variabilité de la coloration.

Cela pourrait améliorer la cohérence de l'évaluation histologique en supprimant la variabilité dépendante de l'opérateur dans le traitement des tissus. Cependant, il convient de noter que la validation directe du TA-PARS dans des tissus réséqués en vrac peut présenter d'autres défis. Il n'existe pas de techniques universellement acceptées pour effectuer une analyse histologique sur des tissus réséqués en vrac. Par conséquent, accéder à une comparaison directe pour valider les images sans étiquette TA-PARS peut être difficile. L'approche prévue consiste à imager des échantillons de tissus en vrac avec le TA-PARS, puis à traiter ces échantillons via le flux de travail histopathologique standard. Cela fournira des visualisations H&E virtuelles et traditionnelles TA-PARS vaguement comparables. Les détails de diagnostic des images H&E virtuelles TA-PARS et des images H&E traditionnelles correspondantes seront ensuite comparés par le biais d'études de validation en aveugle. Bien que les visualisations puissent différer entre le PARS et le H&E, étant donné que la préparation FFPE modifie la structure et la chimie des tissus, le diagnostic de chaque échantillon doit être identique. Par conséquent, cette approche peut faciliter une comparaison diagnostique individuelle entre les images TA-PARS et la méthode de référence actuelle. Idéalement, cette validation directe dans des échantillons de tissus réséqués non traités en vrac peut ouvrir la voie à une adoption clinique.

En résumé, un cadre a été développé pour la coloration virtuelle de type H&E d'images TA-PARS sans étiquette. La méthode proposée exploite les informations directement capturées à partir des trois canaux TA-PARS (absorption radiative, absorption non radiative et diffusion), fournissant un modèle robuste qui génère avec succès des visualisations de type H&E d'échantillons de tissus. L'alimentation du modèle avec les données multimodales fournit une pléthore de données non fournies par un seul mode. Cela peut améliorer considérablement la qualité globale de la colorisation. Plus précisément, cette méthode vise à éviter de déduire les caractéristiques des tissus, pour obtenir des colorisations précises sur le plan diagnostique. Appliquée dans des coupes minces de tissus cutanés humains, la méthode proposée atteint un degré élevé d'accord entre la coloration virtuelle et la coloration histologique de référence. Les dermatopathologistes examinant les images colorisées TA-PARS ont unanimement confirmé l'adéquation diagnostique de ces résultats. Quatre pathologistes indépendants ont indiqué que la colorisation, la résolution et le contraste sont acceptables en tant que substitut H&E. Appliqué aux paramètres cliniques, cela peut permettre d'imager des tissus non colorés, produisant directement des visualisations de type H&E. Une telle technique pourrait réduire les temps d'imagerie histologique, tout en réduisant simultanément la variabilité de la coloration en supprimant les dépendances de l'opérateur dans le processus de coloration histochimique. À l'avenir, une exploration plus approfondie sera menée dans différents types de tissus et différentes variétés de coloration. Nous prévoyons que cette approche ouvrira la voie à une imagerie histologique rapide et sans étiquette des tissus, ce qui est une étape clé vers la microscopie peropératoire pour le diagnostic et l'évaluation des marges.

Les données qui appuient les conclusions de ce manuscrit sont disponibles auprès de l'auteur correspondant, PHR, sur demande raisonnable.

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Les auteurs tiennent à remercier le Cross-Cancer Institute d'Edmonton, en Alberta, pour avoir fourni des échantillons de tissus cutanés humains. Les auteurs remercient également le Dr Gilbert Bigras, le Dr Marie Abi Daoud, le Dr Charlene Hunter et le Dr Karen Naert pour leur examen expert en pathologie des images TA-PARS. Les auteurs remercient les sources suivantes pour le financement utilisé au cours de ce projet. Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (DGECR-2019-00143, RGPIN2019-06134); Fondation canadienne pour l'innovation (JELF #38000); Mitacs Accélération (IT13594); Fonds de démarrage de l'Université de Waterloo; Centre de bioingénierie et de biotechnologie (fonds CBB Seed); illumiSonics Inc (SRA #083181); Fonds Nouvelles frontières en recherche – exploration (NFRFE-2019-01012).

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Benjamin R. Ecclestone et Vlad Pekar

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Deepak Dinakaran et John R. Mackey

Ingénierie de conception de systèmes, Université de Waterloo, Waterloo, ON, N2L 3G1, Canada

Paul Fieguth

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MB a mis en œuvre le cadre, réalisé les expériences, préparé les figures et rédigé le manuscrit principal. BRE a collecté les images TA-PARS et a aidé à rédiger le manuscrit. VP a aidé à planifier les expériences et à préparer les résultats. DD et JRM ont travaillé à la préparation et à la collecte d'échantillons de tissus, ont fourni une rétroaction clinique sur les résultats et ont effectué la consultation clinique lors de l'évaluation des résultats. PF a aidé à planifier les expériences et a fourni des conseils pour la rédaction de manuscrits. PHR a dirigé et organisé le projet et la rédaction du manuscrit en tant que chercheur principal. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Parsin Haji Reza.

Les auteurs BRE, VP, DD, JRM et PHR ont des intérêts financiers dans IllumiSonics, qui a financé les laboratoires PhotoMedicine. Les auteurs MB et PF ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

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Boktor, M., Ecclestone, BR, Pekar, V. et al. Coloration histologique virtuelle de la télédétection photoacoustique à absorption totale sans étiquette (TA-PARS). Sci Rep 12, 10296 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14042-y

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Reçu : 28 mars 2022

Accepté : 31 mai 2022

Publié: 18 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-14042-y

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