Voir la vie sans étiquettes sous des microscopes optiques

Communications Biology volume 6, Article number: 559 (2023) Citer cet article

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Les microscopes optiques d'aujourd'hui ont repoussé les limites de la vitesse, de la qualité et de l'espace observable dans les spécimens biologiques, révolutionnant notre vision de la vie aujourd'hui. De plus, l'étiquetage spécifique des échantillons pour l'imagerie a fourni un aperçu du fonctionnement de la vie. Cela a permis à la microscopie basée sur les étiquettes de s'infiltrer et de s'intégrer dans la recherche traditionnelle en sciences de la vie. Cependant, l'utilisation de la microscopie sans étiquette a été pour la plupart limitée, ce qui a entraîné des tests de bio-application mais pas de bio-intégration. Pour permettre la bio-intégration, ces microscopes doivent être évalués pour leur opportunité de répondre de manière unique aux questions biologiques et d'établir une perspective de croissance à long terme. L'article présente les principaux microscopes optiques sans étiquette et discute de leur potentiel d'intégration dans la recherche en sciences de la vie pour l'analyse non perturbée d'échantillons biologiques.

Historiquement, la microscopie optique a progressé parallèlement aux sciences de la vie. Aujourd'hui, toute installation de recherche biologique standard est équipée d'un microscope pour imager les morphologies en mode fond clair et les distributions moléculaires en mode épifluorescence pour observer les structures marquées d'intérêt. Cette configuration est idéale pour un biologiste, car la plupart des études peuvent être réalisées avec un tel système ou conçues pour y être intégrées. Le besoin de quantification moléculaire et de sectionnement optique précis a fait de la microscopie confocale à balayage laser un favori parmi les biologistes. L'intérêt croissant pour l'imagerie rapide et en direct d'échantillons épais en 3D a servi de retour d'information opportun pour développer des outils d'imagerie tels que les microscopes multiphotons1,2,3,4,5,6 et à feuille de lumière7,8,9. La nécessité d'observer les changements dynamiques cellulaires a encouragé les méthodes basées sur la fluorescence comme le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) 10, 11, la microscopie d'imagerie à durée de vie de fluorescence (FLIM) 12, 13 et la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) 14, 15. L'importance d'observer les moindres détails a motivé les méthodes de super-résolution telles que l'illumination structurée (SIM)16,17, l'épuisement par émission stimulée (STED)18,19 et la localisation d'une seule molécule (SMLM)20,21,22 la microscopie. Les systèmes de support tels que les caméras plus rapides, l'automatisation adaptative à haut débit et les colorants innovants ont encore considérablement élargi les bio-applications. Pourtant, il existe une lacune où les méthodes basées sur les marqueurs sont limitées, c'est-à-dire dans l'évaluation chimiquement non perturbée des échantillons biologiques, sans aucune intervention des marqueurs et des produits chimiques associés.

De nombreuses méthodes d'imagerie sans étiquette bien connues malgré leurs avantages sont limitées lorsque l'objectif est des études mécanistes ou la découverte de connaissances. Par exemple, la microscopie à fond clair, à contraste de phase et à contraste interférentiel différentiel (DIC) est un choix courant pour les biologistes. La microscopie à fond clair est mieux adaptée lorsque les échantillons sont colorés avec un colorant qui confère le contraste. Cependant, pour les études en direct, il est difficile d'obtenir des images à contraste élevé pour des cellules vivantes presque transparentes. Le contraste de phase et l'imagerie DIC augmentent optiquement la différence entre l'échantillon et l'arrière-plan pour générer une image à contraste élevé et sont couramment utilisés avec la microscopie à fluorescence. Le contraste de phase et l'imagerie DIC sont des outils très utiles pour un biologiste. Mais ils ne peuvent pas quantifier les changements de phase, car les valeurs d'intensité sont liées de manière non linéaire aux informations de phase et ne peuvent donc pas être retracées aux changements réels dans l'échantillon.

Aujourd'hui, les progrès de l'imagerie sans étiquette ont permis une imagerie haute résolution et à grande vitesse de la morphologie, de la dynamique, de la fonctionnalité, de l'échange de matériaux, de l'interaction pathogène, de la biochimie et de la biomécanique (Fig. 1). Cet article traite de la vaste sélection de différents microscopes optiques sans étiquette, de leurs applications biologiques et de leur potentiel à devenir un outil puissant de la recherche biomédicale traditionnelle. Cet article vise donc à établir des bases pour choisir des outils de microscopie optique sans étiquette appropriés pour augmenter les méthodes établies et éventuellement jouer un rôle plus intégrateur dans la découverte des connaissances.

La figure illustre l'applicabilité des microscopes optiques sans étiquette disponibles pour évaluer les attributs structurels, biomécaniques et biochimiques des cellules et des tissus en tant que mesure de leurs fonctions. Imagerie de phase quantitative QPM, microscopie à autofluorescence AF, microscopie de génération de deuxième harmonique SHG, microspectroscopie FTIR FTIR, microspectroscopie Raman Raman, microscopie BM Brillouin, élastographie à cohérence optique OCE, tomographie à cohérence optique OCT, D-OCT Doppler-OCT, microscopie photoacoustique PAM.

Le besoin de quantifier les images de phase sans étiquette a motivé les méthodes d'imagerie de phase quantitative qui sont restées largement inexploitées dans la recherche en sciences de la vie. La microscopie de phase quantitative (QPM) est destinée à mesurer les retards de chemin optique (ou les changements de phase) causés par l'échantillon. Étant sans étiquette, QPM permet une imagerie en direct sans toxicité chimique ni perte de signal due à des facteurs externes tels que le photoblanchiment en microscopie à fluorescence. Plusieurs méthodes QPM sont aujourd'hui construites sur la théorie initiale de la formation d'image par Ernst Abbe en 187323 qui a établi une image comme un interférogramme compliqué formé par la superposition d'ondes lumineuses traversant l'échantillon.

QPM doit être évalué pour la fidélité de l'information et la valeur des connaissances biologiques pour résister à l'épreuve du temps. L'aspect le plus important d'un QPM est la gestion du bruit pour établir sa quantifiabilité. Ceci est régi par la sensibilité de phase spatiale et temporelle du système. L'atténuation du bruit est obtenue de plusieurs manières, notamment l'utilisation de diffuseurs, d'un éclairage en lumière blanche et de sources lumineuses à faible cohérence temporelle, ce qui améliore la qualité de l'image. Pour réduire le bruit dû aux actions de balayage, des QPM plein champ sont apparus, qui sont des techniques sans balayage. Les QPM plein champ utilisent l'interférence de la lumière des deux plans (échantillon et référence) pour fournir des informations sur les retards de chemin optique introduits par l'échantillon. Les géométries interférométriques déterminent si le système aura une haute résolution spatiale comme dans le QPM à décalage de phase ou une haute résolution temporelle d'un QPM hors axe24. De plus, les QPM non interférométriques comme la méthode de transport d'intensité obtiennent des informations de phase sans géométrie interférométrique spécialisée mais seulement deux images d'intensité, une nette et une légèrement floue25. Bien que la méthode soit facile à mettre en œuvre sans nécessiter de systèmes très spécialisés, elle est destinée à l'imagerie à basse résolution. Des technologies telles que la microscopie en phase de Fourier (FPM)26, la microscopie holographique numérique (DHM)27, la microscopie en phase de diffraction (DPM)28, la tomographie par diffraction optique (ODT)29, la microscopie spatiale à interférence lumineuse (SLIM)30, l'interférométrie numérique à grand champ ( WFDI)31 sont quelques-unes des principales technologies QPM apparues au fil des ans. L'objectif de QPM aujourd'hui est de passer du développement technologique aux applications pratiques. Aujourd'hui, les technologies QPM ont démontré leur application dans la biologie du développement32, les neurosciences33,34,35, la microbiologie36, la pathologie37, le cancer38, les maladies génétiques31, l'immunologie39, la pharmacologie39, la cicatrisation36 et les troubles métaboliques40. Cependant, l'applicabilité d'une méthode à n'importe quel domaine biologique doit être paramétrée pour assurer l'attrait universel de la méthode.

De manière générale, QPM mesure la morphologie, le dynamisme et les informations de volume dans les cellules. Les caractéristiques morphologiques peuvent être mesurées pour déterminer la croissance, la viabilité, la réponse aux stimuli externes ou la pathologie à l'aide des valeurs de déphasage. Mais la valeur de phase quantifiée est combinée avec la hauteur et l'indice de réfraction. Ainsi, s'il est crucial de déterminer l'un ou l'autre des deux, ils doivent être correctement découplés. Le découplage est en effet pertinent car il peut permettre de mesurer des paramètres supplémentaires tels que le volume et la masse cellulaire. Une méthode de découplage comprend l'utilisation séquentielle de deux milieux d'indice de réfraction différents et la mesure des retards de phase41. D'autres moyens incluent l'utilisation d'angles d'éclairage multiples résultant en une imagerie tomographique et l'utilisation de deux longueurs d'onde dans des milieux hautement dispersifs. La combinaison de QPM avec une puce canalisée (canaux milli/microfluidiques) peut mesurer l'osmolarité intracellulaire, les changements de volume cellulaire, la concentration macromoléculaire, la réponse aux stimuli de choc et le flux temporel du transport moléculaire dans les cellules41. En outre, les données QPM résolues en temps ont été utilisées pour mesurer la diffusion des particules par spectroscopie de phase en relation de dispersion (DPS)42. La technique repose sur la fluctuation d'intensité due aux signaux diffusés de l'échantillon à un angle fixe pour déterminer le débit de particules et prédire les caractéristiques de transport (actif/passif).

La phase est également utilisée de manière innovante pour imager l'adhésion cellulaire sur les surfaces en verre et servir d'analogue sans étiquette de la microscopie à réflexion interne totale (TIRF) par une méthode appelée microscopie à réflexion interférentielle (IRM)43, 44. La méthode produit un contraste d'image basé sur la différence de phase entre la lumière réfléchie par le verre et la zone cellulaire très proche du verre. Ainsi, la surface cellulaire fixée la plus proche du verre apparaît plus sombre en raison d'interférences destructives entre la surface de l'échantillon et les lumières réfléchies par le verre. Bien que la méthode soit utilisée pour l'imagerie de la surface cellulaire et des microtubules avec un contraste élevé45, elle est largement limitée à une région très mince. La combinaison de l'IRM avec la microscopie à fluorescence s'est également révélée fonctionnellement pertinente dans les études dynamiques impliquant des cellules immunitaires46. Ceci est réalisé en suivant les points de contact des lymphocytes T sur une lamelle de protection immunologiquement active, ce qui permet de visualiser les points de contact cellulaires en corrélation avec les niveaux de calcium visibles par fluorescence.

Les mesures de phase par les méthodes d'imagerie discutées jusqu'à présent sont destinées à des échantillons minces ou à des régions proches du verre de couverture. C'est soit parce qu'ils ont une portée limitée du champ d'imagerie, soit parce qu'ils sont submergés par de forts signaux de diffusion provenant des sites hors foyer de l'échantillon.

L'imagerie plus profonde dans les tissus, les organes et les animaux est un défi général de la microscopie optique. Étant donné que l'environnement 3D est crucial pour les fonctions biologiques, il est important d'imager la vie en 3D. Les premiers stades embryonnaires et les petits animaux comme C. elegans, la drosophile et les larves de poisson zèbre se prêtent maintenant tout à fait à la microscopie car ils ne sont pas trop denses optiquement. Le besoin naissant d'imager les processus humains ou mammifères à des échelles de longueur plus petites a suscité un intérêt massif pour les cultures 3D, les sphéroïdes, les tissus modifiés et les organoïdes qui peuvent facilement défier les méthodes optiques disponibles. Si la résolution peut être compromise, il est possible d'accéder à des régions plus profondes de l'échantillon en utilisant des longueurs d'onde lumineuses plus longues. Une technique tomographique basée sur l'interférométrie précédant les QPM est la tomographie par cohérence optique (OCT) qui démontre une résolution spatiale de 5 à 15 μm pour imager jusqu'à des profondeurs de 3 à 5 mm. Cela a aidé l'intégration clinique de l'OCT47 en ophtalmologie, dermatologie, recherche sur le cancer, dentisterie, gastro-entérologie et cardiologie. Des modifications de l'OCT comme l'OCT sensible à la polarisation48, l'OCT-angiographie49, le doppler-OCT50 et l'OCT-élastographie51 ont permis l'imagerie fonctionnelle de la matrice extracellulaire, du flux sanguin et de la rigidité des tissus. Cependant, l'OCT, comme les autres méthodes sans étiquette, souffre de bruit et d'artefacts. En utilisant des composants optiques stabilisateurs pour filtrer la lumière hautement diffusée et une imagerie plus rapide avec le domaine de Fourier, la sensibilité de l'OCT a augmenté. Cependant, la quantification, en particulier des régions de tissus profonds, est affectée par l'atténuation de la lumière. Pour résoudre ce problème, les méthodes de correction d'atténuation sont essentielles pour augmenter la quantification des images OCT dans la détermination de la progression du cancer52 et de la cicatrisation53. Bien que l'OCT pénètre profondément dans les échantillons, il ne peut pas réaliser des échelles inférieures au micron où se cache un trésor de questions biologiques.

L'équilibre entre la profondeur et la résolution est un aspect clé de toute imagerie 3D sans étiquette d'échantillons épais. Pendant longtemps, le QPM n'a pas prospéré dans l'imagerie d'échantillons épais en raison d'une mauvaise gestion de multiples lumières diffusées qui délavaient les détails et entraînaient une mauvaise qualité d'image. Cependant, avec la microscopie interférentielle à gradient de lumière (GLIM) 32, 54, la quantification de phase est réalisable pour plusieurs centaines de microns dans l'échantillon avec la possibilité de créer des tomogrammes permettant la visualisation en coupe. GLIM surpasse tous ses prédécesseurs dans la mesure de la viabilité des embryons, les études physiologiques des cultures 3D, les tissus modifiés, les organoïdes et les organismes vivants (comme C. elegans et le poisson zèbre). GLIM est l'analogue sans étiquette de la microscopie confocale en termes de sa capacité à sectionner optiquement l'échantillon en supprimant les signaux diffusés flous. Ainsi, la résolution GLIM n'est limitée que par la limite de diffraction optique.

Les échantillons biologiques peuvent non seulement changer la phase lumineuse mais aussi la polarisation. Ainsi, la microscopie optique à polarisation (PLM) est apparue comme un bon complément à la microscopie de phase. Le PLM est utilisé pour imager des structures optiquement anisotropes comme les protéines fibreuses comme le collagène55, l'actine56, les microtubules57 et les fuseaux mitotiques58 qui sont autrement difficiles à discerner clairement en microscopie de phase. Le PLM fonctionne avec la lumière traversant deux filtres polarisants avant et après l'échantillon biologique. Idéalement, la lumière du premier filtre ne peut pas traverser le second. Mais l'anisotropie dans l'échantillon oriente la lumière d'une manière qui permettra à une certaine lumière de passer à travers le second filtre permettant la visualisation de ces structures anisotropes présentes dans l'échantillon. En outre, le besoin de quantification a motivé l'émergence du PLM quantitatif (qPLM) pour mesurer des caractéristiques telles que le retard et l'orientation59,60. La complémentarité de la microscopie de phase et de polarisation pour mesurer à la fois la densité et le retardement a alimenté la combinaison des deux méthodes sans étiquette61,62,63. Une variation à haut débit de l'imagerie combinatoire de phase et de polarisation est réalisée en intégrant des méthodes d'apprentissage informatique pour développer une imagerie quantitative sans étiquette avec phase et polarisation (QLIPP)64.

L'imagerie de phase quantitative des échelles cellulaires à subcellulaires exige une résolution supérieure à ce que permet la limite de diffraction. Ceci peut être réalisé en extrayant de manière innovante des informations sur le champ dispersé complexe qui encapsule des détails plus fins de la structure en cours d'imagerie avant la reconstruction. Une méthode consiste à faire tourner l'éclairage ou l'échantillon par rapport à l'autre et à acquérir essentiellement plusieurs perspectives de l'échantillon. Les multiples images 2D sont ensuite reconstruites à l'aide d'algorithmes pour obtenir un tomogramme 3D. Cela améliore la résolution latérale du QPM par un facteur de deux ou plus34,65. 2π-DHM – une méthode spécialisée basée sur DHM – utilise des éclairages à 360°, un laser UV bleu à 405 nm et deux objectifs à huile à grande ouverture numérique (NA) pour atteindre l'objectif34. L'objectif de collecte acquiert la lumière passant à travers les échantillons à différents angles de 0 à 360° capturant des perspectives plus angulaires résultant en l'image jusqu'à une résolution spatiale de 70 nm.

Une autre méthode d'imagerie super-résolution sans étiquette à contraste élevé est le microscope à diffusion cohérente rotative (ROCS)66. Le ROCS peut imager des structures petites (150 nm) et rapides comme les podia cellulaires, les biofilaments et les nanoparticules de type viral. Un laser bleu à rotation rapide produit un éclairage à 360° sur l'échantillon. La lumière diffusée est collectée en quelques millisecondes, ce qui permet une acquisition rapide. La capacité d'imager rapidement des particules de 100 nm sans étiquette a permis de comprendre les interactions virales dynamiques avec les cellules vivantes.

En microscopie avec une résolution spatiale élevée, la réalisation d'une imagerie rapide simultanée est également cruciale dans certaines études biologiques. Capturer l'interaction virus-hôte vivant qui nécessite une résolution spatiale en nanomètres et une résolution temporelle en microsecondes est donc un bon ajustement. Ceci est réalisé par des méthodes sans étiquette comme la microscopie cohérente à fond clair (COBRI)67 et la microscopie à diffusion interférométrique (iSCAT)68,69,70. COBRI est une modification du microscope à fond clair standard en utilisant un éclairage de lumière laser spatialement et temporellement cohérent. Cela se traduit par une résolution spatiale de quelques nanomètres et une résolution temporelle de 10 μs. iSCAT, quant à lui, utilise la lumière diffusée par les nanoparticules telles que les virus avec une sensibilité accrue grâce à l'interférométrie70. Alors que la sortie fluorescente est limitée par la molécule de fluorophore et le photoblanchiment, dans le domaine sans étiquette, la sortie de photons de la diffusion de la lumière peut être augmentée simplement en augmentant la lumière incidente (car un pourcentage fixe de la lumière incidente est diffusé). Avec un rendement plus élevé, moins de temps est nécessaire pour collecter les mêmes informations permettant une imagerie rapide. Cependant, la simple augmentation de l'intensité des photons, en plus de la phototoxicité, introduit une diffusion de fond significative, allant ainsi à l'encontre de l'objectif de la détection ultrasensible. C'est ici qu'intervient la détection de la diffusion interférométrique. Dans iSCAT, la lumière diffusée par les nanoparticules et la lumière réfléchie par l'interface verre/eau sont collectées après une focalisation étroite par un objectif NA élevé. La méthode est idéale pour les particules plus petites (<50 nm) car la différence entre la lumière diffusée et réfléchie est significativement élevée pour créer le contraste requis. En plus de ces méthodes, des méthodes alternatives sans étiquette sont de plus en plus utilisées pour le suivi viral aujourd'hui70,71.

Alors que la microscopie de phase repose sur la modification de la lumière incidente par l'échantillon, les matériaux biologiques regorgent de molécules détectables par des capteurs optiques. La microscopie photoacoustique (PAM) détecte par exemple des pigments tels que l'hémoglobine. PAM excite la cible avec des impulsions laser et la dilatation thermique résultante des pigments émet des ondes mécaniques détectées par le détecteur à ultrasons. La détection par ultrasons permet à PAM d'imager jusqu'à une profondeur de 1 à 3 mm. La résolution latérale est déterminée par la façon dont la lumière est focalisée sur l'échantillon et classe le PAM comme des variations optiquement résolues (résolution de 0,2 à 1 μm jusqu'à 1 mm) ou acoustiquement résolues (résolution de 2 à 15 μm jusqu'à 2 à 3 mm). La résolution latérale de PAM a été poussée à 90 nm grâce à des méthodes innovantes de superrésolution72,73. La PAM est utilisée dans l'étude de la microvascularisation sanguine avec des applications cliniques dans l'évaluation des plaies74,75, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins76, les ulcères du pied diabétique77 et l'angiogenèse78.

Outre les chromophores, notre corps est répandu avec des molécules autofluorescentes. L'autofluorescence est souvent une nuisance en imagerie car elle interfère avec les molécules marquées par fluorescence. Cependant, l'autofluorescence est utilisée pour démêler des processus physiopathologiques clés tels que la transition épithéliale-mésenchymateuse79 et la souche cancéreuse80. Dans l'imagerie par autofluorescence cellulaire, les molécules métaboliques telles que le NADH et le FADH reflètent la taxation de l'énergie cellulaire et sont susceptibles de varier en termes de prolifération, de croissance et de différenciation. D'autre part, dans les tissus, la matrice extracellulaire (ECM) contient du collagène et de l'élastine qui indiquent l'intégrité mécanique du tissu et sont affectées lors du remodelage, de la fibrose et du cancer. En outre, l'autofluorescence peut également être exploitée pour la microscopie à super-résolution afin de visualiser les nanostructures afin d'imager les états de la chromatine dans les cellules81 et la détection histopathologique dans les tissus cancéreux82. L'inconvénient de la spécificité moléculaire l'a limité à des fins de classification des maladies. Des stratégies comprenant l'utilisation de filtres d'excitation et d'émission serrés, des analyses supplémentaires, des repères structurels et des connaissances sur les échantillons peuvent être incorporées pour permettre l'utilité, la fidélité et la quantifiabilité de la méthode.

Les fibrilles ECM comme le collagène et l'élastine sont autofluorescentes mais sont denses et difficiles à valider. L'imagerie de génération de deuxième harmonique (SHG) est une autre méthode sans étiquette qui détecte les structures de fibrilles dans les échantillons biologiques et peut être complémentaire à l'autofluorescence ECM. Outre l'ECM, SHG peut imager des complexes intracellulaires d'actomyosine et des microtubules. Ainsi, il a une valeur dans l'évaluation du potentiel de la maladie83. SHG illustre l'utilisation de la modulation de la lumière pour faire ressortir des informations nano/microstructurales spécifiques dans l'échantillon, telles que la forme fibrillaire. Le principal avantage de SHG est son utilisation de la polarisation de la lumière plutôt que de l'absorption et donc de réduire la phototoxicité et le photoblanchiment. De plus, comme il utilise une lumière proche infrarouge, il peut être utilisé pour imager des échantillons plus épais jusqu'à des centaines de microns. De plus, l'imagerie SHG est spécifique aux structures fibrillaires et offre une sensibilité structurelle élevée. La sensibilité et la spécificité structurelles rendent le SHG transposable à plusieurs applications cliniques telles que les maladies du tissu conjonctif, la fibrose, les affections cardiaques et musculo-squelettiques et les cancers83,84,85. En outre, une amélioration d'au moins 2 fois a été obtenue dans SHG avec plusieurs méthodes de super-résolution5, 86, 87 permettant une quantification précise de la densité fibrillaire et des descriptions structurelles. D'un point de vue technique, la microscopie à deux photons a propulsé une grande partie des développements récents de l'autofluorescence3,88,89,90 et de l'imagerie SHG83,84,85,86,91,92,93,94 en utilisant la microscopie non linéaire.

La détection des changements fonctionnels est essentielle pour comprendre les mécanismes biologiques. Les dosages biochimiques, les transferts moléculaires et les méthodes spectroscopiques sont donc des outils de caractérisation fonctionnelle globalement dans l'échantillon. Compte tenu de la grande hétérogénéité spatiale des échantillons biologiques, des développements cruciaux sont souvent moyennés, ce qui entrave la compréhension d'une pièce manquante des voies biologiques. Par conséquent, la nécessité d'une imagerie fonctionnelle du champ de l'échantillon a conduit les méthodes de coloration chimique et les évaluations microscopiques ultérieures ont grandement aidé les biologistes et les pathologistes95,96,97. Bien que ces méthodes trouvent une utilisation dans la mise en scène d'états fonctionnels tels que la mort, les dommages, l'organisation ou la multiplication, elles sont souvent difficiles à quantifier en raison des subjectivités de la procédure de coloration. De plus, les détails sont limités à la résolution spatiale du microscope optique, ce qui permet d'identifier des changements qui se sont déjà manifestés ou sont à un stade de progression relativement avancé. Certains marquages ​​par fluorescence peuvent également offrir des informations chimiques via l'activation de la fluorescence liée aux conditions98,99, mais étant limités à quelques fonctions biologiques.

Pour comprendre l'apparition précoce des maladies, il faut identifier les changements précoces des groupes fonctionnels chimiques (échelles de longueur de 100 à 200 pm) qui sont bien au-delà de la puissance des microscopes optiques conventionnels, y compris la superrésolution (Fig. 2). Les progrès des méthodes de spectroscopie optique comme la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)100 et la spectroscopie Raman101 comblent ce vide en fournissant des informations sur les modifications des liaisons chimiques et des groupes fonctionnels. Un spectre typique contient plusieurs pics correspondant chacun à une espèce chimique spécifique. La hauteur, la largeur et l'emplacement/les déplacements fournissent des informations clés sur la concentration, la diversité et les longueurs de liaison/énergies de liaison des espèces chimiques. Le facteur limitant de la résolution spectrale est également traité à l'aide d'algorithmes de déconvolution spectrale qui résolvent les pics larges comme les bandes amides pour révéler les sous-pics des structures secondaires des protéines102. De cette façon, les méthodes de spectroscopie sont des compléments parfaits de l'imagerie et, ensemble, peuvent être utiles pour comprendre les mystères de la vie dans la santé et la maladie102. Encore un autre facteur limitant est l'identification d'informations chimiques spatialement appariées dans l'échantillon hétérogène. Ce besoin a été largement satisfait par les versions de microscopie spectrale ou de microspectroscopie de FTIR103 et Raman104,105,106. Les méthodes de microspectroscopie utilisent le même principe que leur homologue de spectroscopie avec la capacité supplémentaire d'une lentille d'objectif de balayer spatialement l'échantillon. Ainsi, nous avons une pile d'images avec une image pour chaque longueur d'onde sur la gamme spectrale du système d'imagerie. La microspectroscopie, tout comme la contrepartie de la spectroscopie, souffre des mêmes limitations que les équivalents de la spectroscopie telles que la gestion du bruit, la nécessité d'ajustements de la ligne de base, l'atténuation de l'autofluorescence (pour Raman) et les signaux interférents provenant du substrat ou de la teneur en eau. Néanmoins, avec une meilleure gestion du bruit et une résolution spectrale et spatiale accrue, des informations biochimiques plus détaillées peuvent être extraites.

La microscopie optique et la spectroscopie détectent différentes échelles d'organisation et sont donc complémentaires pour visualiser différentes phases de développement et de maladie. La microscopie optique même avec la super-résolution ne peut pas dépasser 1 nm. La microspectroscopie détecte les changements chimiques se produisant au niveau des groupes fonctionnels avec la distribution spatiale. Cependant, avec des milliers de changements chimiques se produisant, il est difficile d'utiliser la spectroscopie seule, en particulier au début, jusqu'à ce qu'elle soit corrélée avec des changements structurels manifestés se produisant à l'échelle du micron à l'échelle nanométrique. Cela peut aider à caractériser l'apparition précoce de la maladie ainsi qu'à comprendre la base de plusieurs événements physiologiques et pathologiques.

La microscopie et la microspectroscopie peuvent être judicieusement utilisées corrélativement pour prédire les changements très précoces des systèmes biologiques (Fig. 2). Pendant longtemps, la résolution de la microspectroscopie n'a pas été adaptée aux microscopes avancés. En effet, le premier collectait encore des informations spectrales à partir d'une zone couvrant plusieurs pixels. Cela a changé au fil des ans lorsque la nanoscopie a été portée à la fois à la microspectroscopie FTIR107,108,109 et Raman110,111,112,113 permettant une résolution spectrale et spatiale à haute résolution pour une comparaison point à point avec d'autres méthodes d'imagerie à haute résolution. En outre, la croissance de l'imagerie spectrale à grande vitesse114 et le piégeage d'une seule molécule115, 116 modifications ont amélioré la précision de l'imagerie des cellules vivantes et in vivo117.

L'imagerie optique non linéaire par des microscopes à deux photons a non seulement permis l'autofluorescence et l'imagerie SHG, mais également des méthodes d'imagerie spectrale telles que la diffusion Raman cohérente anti-stokes (CARS) et la microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) pour l'imagerie des protéines, des gouttelettes lipidiques et des protéines nucléiques. acides118,119. CARS et SRS sont tous deux des images optiques non linéaires et utilisent plusieurs étapes d'excitation pour collecter des informations chimiques à partir d'une région spectrale spécifique à une espèce chimique. Les régions d'étirement C – H et les régions d'empreintes protéiques sont les plus largement utilisées. Ces régions étant spectralement encombrées entraînent le chevauchement de plusieurs espèces chimiques, interférant ainsi dans l'identification des contributions d'un groupe fonctionnel particulier. Cependant la déconvolution spectrale peut être utilisée dans certains cas pour récupérer de l'information pure dans de nombreux cas120,121.

Comme les récepteurs chimiques à la surface des cellules, il existe également des mécano-récepteurs qui peuvent traduire les forces biophysiques pour permettre l'expression des gènes et moduler les fonctions biologiques. La mécanobiologie a été démontrée dans les cellules souches122, la progression tumorale123, les maladies neurodégénératives106, la biologie du développement124, la biologie régénérative125, l'adhésion cellulaire et la migration126. De nombreuses études biomécaniques sur les cellules et les tissus sont aujourd'hui réalisées de manière indirecte en marquant des molécules mécanosensibles et en observant leurs expressions et leur localisation en microscopie à fluorescence. Cependant, l'imagerie directe des changements mécaniques dynamiques des cellules vivantes et des tissus sans étiquette aiderait à comprendre les changements dynamiques de la santé et la progression de la maladie.

Les deux modalités d'imagerie mécanique les plus populaires sont la microscopie à force atomique (AFM) et l'élastographie par ultrasons (USE). L'AFM est destiné à des échelles extrêmement petites (1 nm - quelques microns) de forces physiques fournissant des informations mécaniques de surface. UTILISER des images à l'échelle de l'organe avec pénétration trans-corporelle et donc adaptées aux milieux cliniques. Cependant, il existe un écart dans l'échelle de longueur entre quelques microns et quelques millimètres (cellules et tissus) qui a un énorme potentiel pour l'exploration biomécanique.

L'analogue optique de USE est l'élastographie par cohérence optique (OCE) qui est une avancée fonctionnelle de l'OCT. L'OCE utilise une source externe de déformation tissulaire qui peut être basée sur le contact ou sans contact pour mesurer les déplacements tissulaires51,127. OCE peut déterminer la rigidité mécanique à des profondeurs de plusieurs millimètres dans des échantillons non homogènes, ce qui est idéal pour les tissus biologiques, les modèles 3D in vitro et les modèles de petits animaux. Cependant, la limitation reste la résolution qui est en dizaines de microns. Cela limite ses applications là où des résolutions cellulaires ou subcellulaires sont justifiées.

La microscopie Brillouin est une imagerie mécanique sans étiquette offrant une résolution limitée par la diffraction basée sur les principes de la diffusion de la lumière Brillouin128 pour mesurer le module longitudinal129 ou de cisaillement130. La diffusion Brillouin est un événement de diffusion inélastique qui se produit en raison de l'interaction des photons de la source lumineuse et des phonons (vibrations mécaniques) de l'échantillon. Les phonons interagissent avec la lumière incidente en échangeant de l'énergie et en résultant en une population de lumière diffusée de manière inélastique (diffusion Brillouin). Ces diffusions Brillouin fournissent donc une mesure de la propriété mécanique de l'échantillon. La microscopie Brillouin est aujourd'hui appliquée aux cellules et aux tissus avec une vitesse élevée et une faible phototoxicité129. Dans les cellules, les changements mécaniques proviennent des modifications du cytosquelette, des jonctions d'interactions cellule-cellule ou cellule-matrice, et de la fraction volumique solide-liquide du cytoplasme et des membranes. Dans la matrice extracellulaire des tissus, la disposition, la réticulation et la densité des protéines sont responsables des propriétés mécaniques. La microscopie Brillouin a été démontrée dans plusieurs modèles biologiques et maladies. Il a été utilisé dans la biologie cellulaire131, la biologie du développement132, l'estimation du potentiel métastatique des tumeurs133, le dépôt de plaque dans la maladie d'Alzheimer104 et le raidissement de la MEC dans l'athérosclérose134 pour n'en nommer que quelques-uns. Une limitation de l'utilisation de la microscopie Brillouin pour mesurer les propriétés élastiques vient de la nécessité d'une connaissance préalable de la densité et de l'indice de réfraction du tissu. De plus, la fiabilité de la méthode n'est pas tout à fait évidente sur des échantillons biologiques hétérogènes, en particulier dans des états dynamiques. Cela est dû à un décalage possible entre les temps de relation mécanique et le temps dans lequel les événements biologiques réels se produisent. Bien que des latitudes existent pour améliorer la résolution temporelle du microscope, pour l'instant, il est crucial de tenir compte des limitations et des structures d'image qui peuvent être adaptées dans la plage de vitesse plus lente que la relaxation acoustique. De plus, étant donné que les changements mécaniques ont un impact sur le comportement chimique et vice versa, l'imagerie mécanique et chimique corrélative peut être essentielle pour révéler les relations de cause à effet dans les processus vitaux104. De plus, la prise de conscience du fait que les activités mécaniques sont multiformes et non linéaires et non une simple mesure de rigidité contribuera grandement à répondre correctement aux questions biologiques.

Bien que les microscopes sans étiquette aient un potentiel énorme dans de nombreux aspects des échantillons biologiques, certaines cibles biologiques sont plus propices à la microscopie optique sans étiquette et ont une grande pertinence pour la recherche biomédicale, nous les appelons super biotargets (tableau 1). Compte tenu des améliorations majeures apportées au cours des deux dernières décennies aux microscopes optiques sans étiquette, il existe un énorme potentiel d'amélioration de la vitesse, de la résolution, de la précision quantitative, de la sélectivité et de la possibilité d'une analyse automatisée.

Résolution : L'intérêt pour la microscopie à superrésolution s'est rapidement accru pour les bio-applications permettant d'observer de plus petites entités en action. Les méthodes de superrésolution basées sur la fluorescence telles que STORM, STED, PALM et SR-SIM135 répondent à cette demande. L'énorme intérêt pour la superrésolution et les limitations associées à l'étiquetage ont motivé la nanoscopie optique sans étiquette. Aujourd'hui, le domaine de la nanoscopie sans étiquette existe avec des bio-applications démontrées dans l'imagerie de phase34, l'imagerie photoacoustique73, l'autofluorescence81 et le SHG6. La promesse de ceux-ci bénéficierait davantage d'un renforcement en résolvant la spécificité et la caractérisation des artefacts.

Rapidité : La réalisation de l'imagerie ultrarapide n'est pas nouvelle. Accélérer le temps d'imagerie sans compromettre la qualité de l'image est réalisable grâce à l'utilisation d'un matériel optique innovant comprenant un éclairage à motifs, une mise au point ultra-rapide et une détection efficace136,137. L'objectif principal est de capturer les mouvements rapides du corps à travers des échelles allant du cœur battant au trafic de fret subcellulaire. La rapidité de l'imagerie se fait au détriment d'une capture efficace des informations. Cela inclut l'inclusion fiable des signaux provenant de l'échantillon et la gestion efficace du bruit sans compromettre la qualité de l'image.

Précision : La précision d'imagerie est la fidélité des systèmes d'imagerie à transmettre de manière fiable les informations de l'échantillon. L'ingénierie de l'éclairage, la manipulation des échantillons et les systèmes de détection peuvent améliorer le rapport signal sur bruit qui diminue les artefacts. Cependant, le bruit fait souvent partie intégrante du signal et peut même véhiculer des informations cruciales qui, lorsqu'elles sont exploitées, peuvent révéler des informations cachées. Ainsi, la caractérisation de ce qui est perçu comme du bruit peut être utile. Les simulations informatiques peuvent modéliser l'interaction lumière-échantillon et plus précisément les signaux qui devraient être détectés par le système microscopique. Le défi de la modélisation informatique actuelle consiste à déballer ces convolutions pour exploiter le soi-disant bruit contribuant à un signal plus utilisable par acquisition conduisant à une imagerie plus rapide et plus précise dans les trois axes spatiaux.

Sélectivité : la sélectivité spatiale implique l'imagerie précise de l'espace 3D de l'échantillon. Une précision améliorée apporte des informations plus sélectives tout en rejetant les signaux provenant d'ailleurs. Bien sûr, cela est essentiel pour intégrer l'imagerie optique sans étiquette dans la recherche biologique traditionnelle. Il est essentiel dans le diagnostic médical où la présence d'un composant spécifique est un marqueur de la maladie. La sélectivité peut être abordée de plusieurs façons. La plus courante consiste à comparer des références connues avec des normes. Bien qu'il soit souvent constaté que les exigences exactes des normes ne conviennent pas à une nouvelle méthode et sont conçues pour s'adapter aux normes existantes. L'autre façon est de trouver des facteurs d'identification inhérents comme la forme ou la texture. Par exemple, dans la carte de phase des cellules, les mitochondries et les filaments d'actine sont visibles, et le QPM peut être utilisé pour les distinguer par multiplexage virtuel à l'aide d'une mesure comme l'indice de réfraction. Dans l'imagerie par autofluorescence, les mesures inhérentes peuvent être simplement les filtres d'excitation et d'émission pour permettre l'imagerie de molécules spécifiques.

Automatisation : des outils informatiques peuvent être utilisés pour évaluer, identifier, apprendre et informer les utilisateurs finaux sur des structures autrement impossibles à distinguer. Cela peut être une tâche volumineuse lors de son développement, mais cet étiquetage virtuel des structures spécifiques peut être gratifiant à long terme pour des services à haut débit tels que le dépistage clinique et l'aide au diagnostic. L'apprentissage en profondeur est un outil puissant pour réaliser des tâches telles que la classification entre les groupes de test. Cependant, il est important de réaliser la base des décisions de calcul. Présente actuellement un intérêt pour les informaticiens travaillant sur des réseaux de neurones interprétables avec un potentiel d'exploration de connaissances et de découvertes fondamentales.

Ainsi, la microscopie optique sans étiquette a parcouru un long chemin pour repousser les limites de l'imagerie en direct non perturbée à multiples facettes des processus biologiques. Mais un problème persistant est le problème de la phototoxicité qui existe aujourd'hui dans les techniques de microscopie optique causée par la lumière d'éclairage. C'est un gros problème en imagerie fluorescente138. Dans le domaine sans étiquette, la phototoxicité avec un éclairage à large bande comme QPM est relativement faible24 mais reste significative dans les modalités à base de laser comme SHG, CARS et l'imagerie spectrale (jusqu'à GW/cm2 avec des impulsions laser femtosecondes)139. La phototoxicité introduit de minuscules changements moléculaires à génétiques limitant une imagerie véritablement non perturbée de la vie. Étant donné que la phototoxicité dépend de plusieurs facteurs, notamment le type de microscopie, le choix de la longueur d'onde, la préparation de l'échantillon et le type d'échantillon. Ainsi, les protocoles et les systèmes doivent évoluer pour garantir les meilleures pratiques en matière d'imagerie en direct.

En matière de bioimagerie, le tout est vraiment plus grand que la somme des parties. Les cinq aspects du développement d'un microscope sans étiquette (Fig. 3) élargiront la sphère globale de plus de détails cachés capturés. Cependant, des microscopes avec une résolution, une vitesse et un champ de vision meilleurs continueront d'émerger, mais cela ne suffira peut-être pas à lui seul à répondre aux questions fondamentales de la biologie et à s'intégrer ainsi à la recherche biologique. Des stratégies doivent être entreprises pour assurer l'intégration plutôt que l'application. La combinaison de plusieurs microscopies optiques sans étiquette peut bénéficier de l'aspect multimodalité qui peut se compléter en comblant les pièces manquantes d'une étude. En outre, l'imagerie corrélative des méthodes sans étiquette et basées sur l'étiquette peut renforcer non seulement la recherche biologique, mais également créer de nouveaux créneaux pour l'utilisation de la microscopie sans étiquette. Les techniques de marquage et de microscopie à fluorescence ont fait leurs preuves et ne sont pas seulement des bêtes de somme pour des résultats de haute précision et à haut débit, mais aussi les principaux moteurs pour rapprocher la microscopie des scientifiques de la vie en créant des jalons qui ont façonné notre compréhension de la vie aujourd'hui. Les développements de sondes telles que les protéines endogènes et les colorants vivants respectueux des cellules permettent également l'imagerie en direct. Cependant, une complémentarité existe entre les microscopes à marquage et les microscopes sans marquage. Comprendre la complémentarité à double sens, c'est mieux comprendre les mystères de la vie. Les étiquettes nous aident à avoir une confiance spécifique dans la mer de milliers de molécules. Les microscopes sans étiquette fournissent les caractéristiques biologiques dans leur ensemble et regorgent donc d'informations. Ainsi, les changements dans un système peuvent souvent être observés avec de telles méthodes et aider à la formulation d'hypothèses. Les méthodes basées sur les étiquettes peuvent aider à extraire les principaux résultats de cette mer d'informations en utilisant des étiquettes spécifiques pour valider ou invalider ces hypothèses. Ainsi, les études doivent fonctionner avec une poignée de main entre les deux microscopies pour maximiser le résultat de la recherche en sciences de la vie.

La figure illustre le potentiel de croissance technologique des microscopes optiques sans étiquette. Le cercle central montre la limite actuelle de la microscopie optique sans étiquette, et les pétales représentent les différents aspects où elle peut se développer et éventuellement élargir la portée des microscopes sans étiquette pour l'imagerie biologique. Le potentiel de croissance réel réside cependant fortement dans l'intégration des techniques dans les routines biomédicales standard.

Le développement de plus d'outils d'adaptation qui agissent comme des ponts entre les biologistes et les développeurs de microscopes sans étiquette doit émerger pour rendre les microscopes sans étiquette indispensables aux biologistes. Un bel exemple d'un tel outil d'adaptation dans le marquage fluorescent est la découverte de la protéine de fluorescence - GFP qui a apporté un changement révolutionnaire dans la recherche biologique grâce aux microscopes à fluorescence. De même, dans le domaine sans étiquette, un outil adaptateur potentiel peut être des fantômes d'étalonnage et de quantification fabriqués par l'ingénierie des matériaux pour développer des cibles bien définies pour l'indice de réfraction, la diffusion et les coefficients d'absorbance140. Les étiquettes vibratoires141 pour l'étalonnage des liaisons chimiques dans l'imagerie spectrale telles que Raman, CARS et SRS sont également de bons exemples pour l'imagerie chimique. Des fantômes imitant les tissus142 avec des propriétés mécaniques définies peuvent permettre une élastographie microscopique. Cette intégration de la recherche en imagerie à la recherche en chimie et en science des matériaux pour développer des outils de normalisation et d'analyse comparative pour les microscopes sans étiquette peut avoir un impact à long terme sur la généralisation de ces microscopes.

La nécessité d'un effort actif pour créer de la valeur dans les sciences de la vie constitue un autre défi pour intégrer l'imagerie sans étiquette à la recherche biologique courante. Cela signifie identifier des points communs avec les technologies éprouvées existantes et trouver des moyens innovants d'utiliser l'imagerie sans étiquette pour répondre aux questions biologiques. De nombreuses méthodes sans étiquette comme IRM et iSCAT peuvent simplement être ajoutées aux configurations de microscope confocal existantes avec quelques modifications. De plus en plus d'entreprises dérivées développent des microscopes à phase quantitative sans étiquette et créent une disponibilité commerciale avec des interfaces conviviales telles que phi-optics Inc et les microscopes nanolive143. Les méthodes de microscopie non linéaire à deux photons telles que SHG et CARS sont disponibles dans le commerce auprès de sociétés de microscopie de longue date telles que Zeiss et Leica. Une autre approche est une collaboration à long terme entre les développeurs de microscopie et les installations biologiques pour établir des systèmes de travail sur le site de l'expérience et travailler en étroite collaboration pour affiner à la fois la méthode et la valeur biologique.

L'avantage des microscopes sans étiquette réside dans la diversité des aspects biologiques qu'ils peuvent surveiller, allant de la modulation de la lumière, de l'échange d'énergie, de la chimie et de la mécanique. Toutes ces propriétés sont inhérentes aux matériaux biologiques et sont donc des informations dans leurs états natifs dépourvus de perturbations externes pour résoudre les questions brûlantes qui existent en biologie aujourd'hui. Ainsi, les décideurs politiques, les agences de financement, les investisseurs et l'industrie doivent exploiter le potentiel de la microscopie sans étiquette avec les biosciences et motiver une main-d'œuvre importante dédiée à la réalisation de telles activités à l'avenir.

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Biswajoy Ghosh et Krishna Agarwal

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BG et KA ont conceptualisé et révisé l'article. BG a écrit l'article et conçu les figures.

Correspondance à Biswajoy Ghosh ou Krishna Agarwal.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Marco Fritzsche et Manuel Breuer. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Ghosh, B., Agarwal, K. Visualisation de la vie sans étiquettes sous des microscopes optiques. Commun Biol 6, 559 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04934-8

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Reçu : 21 février 2023

Accepté : 12 mai 2023

Publié: 25 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04934-8

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