Rapide, étiquette

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 48 (2023) Citer cet article

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La biopsie est la norme recommandée pour le diagnostic pathologique du carcinome du foie. Cependant, cette méthode nécessite généralement une coupe et une coloration, et des pathologistes bien formés pour interpréter les images tissulaires. Ici, nous utilisons la spectroscopie Raman pour étudier des échantillons de tissus hépatiques humains, en développant et en validant un flux de travail pour le diagnostic pathologique in vitro et peropératoire du cancer du foie. Nous distinguons les tissus cancéreux des tissus non tumoraux adjacents de manière rapide, non perturbatrice et sans étiquette en utilisant la spectroscopie Raman combinée à un apprentissage en profondeur, qui est validé par la métabolomique tissulaire. Cette technique permet une identification pathologique détaillée des tissus cancéreux, y compris le sous-type, le grade de différenciation et le stade de la tumeur. Des images Raman 2D/3D de tranches de tissus humains non traités avec une résolution submicrométrique sont également acquises sur la base de la visualisation de la composition moléculaire, ce qui pourrait aider à la reconnaissance des limites tumorales et au diagnostic clinicopathologique. Enfin, le potentiel d'un système Raman portatif est illustré pendant la chirurgie pour le diagnostic peropératoire en temps réel du cancer du foie humain.

Le cancer du foie était le septième cancer le plus fréquent et la troisième cause de décès lié au cancer dans le monde en 20201. L'incidence des nouveaux cas diagnostiqués et les taux d'incidence du cancer du foie normalisés selon l'âge ont continué d'augmenter à l'échelle mondiale au cours des dernières décennies, malgré des les progrès du diagnostic et de la thérapie2,3.

Par conséquent, un diagnostic précis et rapide est crucial pour le traitement du cancer du foie et l'amélioration du taux de survie. Le test sérologique associé à l'imagerie est la méthode standard pour le diagnostic du carcinome hépatique4. Cependant, la sensibilité diagnostique du test sérologique le plus couramment utilisé, qui dose l'alpha-foetoprotéine (AFP), est d'environ 60 %5. Les tests d'imagerie tels que l'imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomodensitométrie (CT) et l'échographie (US) ont une sensibilité et une spécificité élevées pour la détection du cancer du foie, en particulier chez les patients atteints de cirrhose du foie6. De tels tests d'imagerie souffrent cependant d'une résolution spatiale limitée, d'une complexité du diagnostic peropératoire et/ou comportent un risque d'exposition aux rayonnements ionisants7. Par conséquent, la biopsie est toujours recommandée comme référence pour le diagnostic pathologique, ce qui est important pour le pronostic et l'orientation du traitement4.

Cliniquement, les observations histopathologiques sont généralement réalisées avec une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) ou immunohistochimique. La procédure de coloration prend du temps et ne convient que pour le diagnostic à l'aide de tissus isolés. De plus, le nombre limité de spécialistes en pathologie peut restreindre l'utilisation de l'histopathologie6. Récemment, la pathologie numérique utilisant l'analyse d'images à haut débit a grandement aidé les pathologistes dans l'identification et la classification des échantillons de tissus8,9. Cependant, la préparation des échantillons pour la pathologie numérique souffre des mêmes limites que les méthodes traditionnelles. Par conséquent, des techniques sont nécessaires pour une investigation in vitro et même in vivo plus rapide et non perturbatrice du cancer du foie.

L'histopathologie spectrale basée sur la spectroscopie Raman offre une approche alternative au diagnostic du cancer10. La spectroscopie Raman est une technique optique basée sur la diffusion inélastique de la lumière par des molécules vibrantes qui fournit des empreintes chimiques d'échantillons biologiques complexes, et la plupart des informations biomoléculaires sont disponibles avec un simple instantané avec la mesure Raman. Il est important de noter que la structure chimique et la composition des échantillons biologiques peuvent être obtenues par spectroscopie Raman d'une manière sans tache et non destructive avec une préparation d'échantillon minimale11,12,13,14. Les informations spectrales peuvent également être combinées avec des algorithmes d'intelligence artificielle pour établir un modèle de classification diagnostique permettant un diagnostic automatique15,16,17,18. De plus, l'imagerie par spectroscopie Raman permet de délimiter les marges tumorales et de visualiser les régions lésionnelles d'intérêt qui sont invisibles à l'œil nu19. Ces caractéristiques rendent la spectroscopie Raman possible pour l'examen d'échantillons de tissus isolés et l'assistance des chirurgiens pour identifier les marges des tumeurs, facilitant une élimination plus complète avec un minimum de dommages aux tissus normaux.

Jusqu'à présent, des recherches ont été menées sur l'utilisation de la spectroscopie Raman pour le diagnostic pathologique de plusieurs tissus biologiques, notamment le cerveau20, le sein21, la peau22,23, le côlon24 et la vessie25. Pour le cancer du foie, les études basées sur la spectroscopie Raman se sont principalement concentrées sur l'analyse d'échantillons sanguins, avec seulement quelques études visant des tissus humains.

De plus, il est connu que l'hétérogénéité des tissus tumoraux et l'éventuelle infiltration du carcinome augmentent la variabilité des données spectrales recueillies à partir des tissus. Par conséquent, il est nécessaire de collecter un grand nombre de spectres de chaque échantillon de tissu pour mieux représenter les données, mais cela peut augmenter la complexité de l'analyse des données et poser un défi pour les méthodes chimiométriques traditionnelles. La nature axée sur les données de l'apprentissage en profondeur est bien adaptée pour résoudre ce problème17. L'apprentissage en profondeur peut extraire et apprendre des caractéristiques cachées directement à partir de données massives et a été appliqué avec succès dans le domaine de la reconnaissance d'images, y compris l'analyse d'images biologiques et médicales26,27,28. Grâce à la flexibilité de son architecture, le deep learning a également été étendu pour analyser des données séquentielles unidimensionnelles, comme les données spectrales29,30. Quelques rapports ont décrit l'apprentissage en profondeur pour le diagnostic médical à l'aide de données spectrales Raman 1-D18,31.

Dans cette étude, nous avons rapporté l'exploration du tissu de l'hépatopathie humaine à l'aide de la spectroscopie Raman. Nous avons d'abord réussi à distinguer les tissus de carcinome hépatique des tissus non tumoraux adjacents en utilisant la spectroscopie Raman combinée à un réseau de neurones convolutionnels (CNN) basé sur VGG-16, de manière rapide, non perturbatrice et sans étiquette. Une identification pathologique plus détaillée a ensuite été faite des tissus du cancer du foie, y compris le sous-type, le degré de différenciation et le stade de la tumeur. L'analyse métabolomique tissulaire a confirmé la fiabilité de la spectroscopie Raman dans l'identification des métabolites. De plus, les images Raman de blocs de tissus humains non traités et de tranches de tissus à une résolution submicrométrique ont permis la visualisation de leur composition moléculaire, facilitant l'identification des limites tumorales et le diagnostic clinicopathologique. Enfin, un système de spectroscopie Raman portable a été utilisé pendant la chirurgie pour explorer la faisabilité du diagnostic peropératoire du cancer du foie en temps réel. Un flux de travail graphique du diagnostic histopathologique du tissu hépatique et du diagnostic peropératoire basé sur la spectroscopie Raman et un algorithme intelligent est illustré à la Fig. 1.

De grands ensembles de données Raman acquis à partir de tissus hépatiques ont été collectés et introduits dans un modèle d'apprentissage en profondeur basé sur CNN pour l'entraîner à distinguer les données spectrales de différents types de tissus. Le modèle a ensuite été utilisé pour différencier différents types pathologiques de tissus cancéreux du foie. De plus, les résultats Raman ont été validés par la métabolomique tissulaire basée sur la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). De plus, des images Raman ont été utilisées pour visualiser la composition moléculaire de blocs de tissus humains non traités et de tranches de tissus. Enfin, un système Raman portable a été utilisé pendant la chirurgie pour le diagnostic peropératoire en temps réel du cancer du foie.

Une longueur d'onde d'excitation de 532 nm a été utilisée pour les mesures Raman rapportées ici, alors que des longueurs d'onde plus longues sont généralement recommandées pour l'analyse d'échantillons biologiques afin d'éviter les signaux de fond de fluorescence et d'obtenir une pénétration plus profonde de la lumière. Cependant, par rapport aux longueurs d'onde plus longues (telles que 633 ou 785 nm, respectivement), les longueurs d'onde plus courtes ont fourni une qualité de données et un rapport signal sur bruit supérieurs pour les spectres Raman (Fig. 1 supplémentaire), qui résultaient en partie de l'amplification résonnante d'une protéine spécifique. et les bandes associées aux caroténoïdes32.

Les spectres Raman de tissus de carcinome hépatique appariés et de tissus adjacents non tumoraux ont été acquis auprès de 120 patients atteints d'un cancer du foie. Des informations détaillées sur les patients sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. En raison de l'hétérogénéité et de la complexité des tissus cancéreux (Fig. 2 supplémentaire), au moins 50 spectres ont été collectés à partir de points sélectionnés au hasard à la surface de chaque échantillon de tissu. Une comparaison des spectres Raman moyens obtenus à partir d'échantillons de tissus de carcinome et de paracarcinome est illustrée à la Fig. 2a. Dix-neuf pics Raman caractéristiques ont été observés à partir de la plupart des échantillons de tissus. Les pics Raman des deux groupes se chevauchaient largement, mais l'intensité de chaque pic dans le groupe tissu paracarcinome est significativement plus élevée que celle dans le groupe tissu cancéreux (test t de Student, P < 0,05). Des cartes thermiques regroupées de manière hiérarchique des pics Raman caractéristiques ont été tracées pour prédiscriminer les pics Raman étroitement liés (Fig. 3 supplémentaire). Le tableau supplémentaire 2 donne la position du pic et les composés représentatifs correspondants des principaux modes vibrationnels Raman rapportés dans la littérature33.

a–d Les spectres Raman moyens de 120 échantillons de tissu de carcinome et de 120 échantillons de tissu de paracarcinome (a), des échantillons de tissu cancéreux de patients atteints de CHC et de CIC (b), des échantillons de tissu de CHC à différents stades tumoraux (c) et des échantillons de tissu de CHC avec différents cancers grades de différenciation cellulaire (d). Les zones ombrées représentent les écarts-types de la moyenne. e et f Photographies typiques de tissu paracancer (à gauche) et d'échantillon de tissu de cancer du foie (à droite) (e) et les images correspondantes des tissus colorés H&E (f) de 120 échantillons testés dans cette étude. g Test Raman du tissu hépatique avec un spectromètre micro-Raman. h L'architecture du modèle d'apprentissage en profondeur basé sur VGG-16. Des données Raman composées de 12 000 spectres ont été introduites dans la couche convolutive initiale avec 64 filtres. Chaque couche convolutionnelle avait une taille de noyau de 3, se connectant à une couche d'activation ReLU. Une couche d'abandon a été utilisée dans les couches de connexion complètes, en suivant les blocs de base. La mise en commun maximale (taille 2, foulée 2) a été utilisée entre les blocs pour réduire la longueur des données. Les nombres sous chaque bloc se réfèrent respectivement à la longueur et au nombre de canaux de sortie. i, j Perte d'entropie croisée (i) et précision (j) dans l'entraînement itératif du CNN. L'entropie croisée représente l'erreur quadratique moyenne entre la valeur prédite et la valeur réelle. k Matrices de confusion binaires pour la classification de quatre catégories de tissus selon l'algorithme CNN en pourcentage (%). l Courbes ROC et valeurs AUC correspondantes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

La plupart des pics pourraient être attribués aux acides aminés aromatiques, aux protéines et aux caroténoïdes. Plus précisément, les pics à environ 749, 1212, 1393, 1547, 1586 et 1602 cm-1 sont liés au tryptophane, à la tyrosine ou à la phénylalanine, respectivement. La bande à 1637 cm-1 correspond à l'étirement C = O de la bande amide I. Les lignes Raman à 1003, 1156 et 1519 cm−1 représentent les étendues C–C et C–N des caroténoïdes. Le pic à 1003 cm-1 a également été rapporté comme étant associé à l'AFP, un biomarqueur du carcinome hépatocellulaire (CHC)34. De plus, les caractéristiques Raman apparaissant à 1081, 1130 et 1304 cm-1 sont principalement liées aux lipides ou aux acides gras. Les bandes à 674, 974, 1336 et 1356 cm-1 peuvent être attribuées aux acides nucléiques. De plus, la signature Raman autour de 835 cm−1 est liée aux saccharides. De telles différences dans les spectres Raman entre les tissus paracancéreux et cancéreux reflètent les variations des composants biochimiques du tissu hépatique causées par la carcinogenèse, qui fournit une base pour différencier les tissus cancéreux des tissus normaux.

Ensuite, la différenciation histopathologique fine du cancer du foie basée sur la spectroscopie Raman a été explorée plus avant. Le cancer primitif du foie est l'un des cancers les plus courants dans le monde, dont 75 à 85 % et 10 à 15 % sont des carcinomes hépatocellulaires (CHC) et des cholangiocarcinomes intrahépatiques (CCI), respectivement35. Comme le montre la figure 2b, les principales différences d'intensité du signal Raman entre les groupes HCC et ICC se situaient au niveau des pics Raman liés aux caroténoïdes (1003, 1156 et 1519 cm-1), qui étaient significativement plus élevés dans le groupe ICC. En revanche, la plupart des pics liés aux acides aminés, aux lipides et aux acides nucléiques, tels que 749, 974, 1304, 1356, 1393 et ​​1586 cm-1, respectivement, étaient plus élevés dans le groupe HCC. De plus, un jugement précis du stade de la tumeur et du degré de différenciation peut aider au choix de la stratégie de traitement et à l'évaluation du pronostic. Comme le montre la figure 2c, les principales différences spectrales entre les stades précoce et avancé ont été trouvées à 1003, 1156, 1519 cm−1 (caroténoïdes), 1130 cm−1 (acides gras), 749 et 1547 cm−1 (tryptophane), qui avaient une intensité plus élevée dans le groupe au stade précoce, tandis que les pics liés aux acides nucléiques à 674 et 974 cm-1 et au saccharide à 835 cm-1 étaient plus élevés dans le groupe au stade avancé. De plus, la Fig. 4 supplémentaire montre les spectres Raman de différentes catégories de différenciation du cancer. La différence spectrale globale entre les groupes modérément et faiblement différenciés était plus significative que celle des groupes bien et modérément différenciés. Semblable aux différences entre les groupes de cancer et de paracancer, les groupes bien et modérément différenciés présentaient également une intensité spectrale globale plus élevée, en particulier dans les pics liés aux caroténoïdes (Fig. 2d). Le type pathologique de chaque bloc de tissu a été reconfirmé par le pathologiste sur la base de la coloration H&E après le test Raman (Fig. 2e – g).

Pour classer différents types de tissus hépatiques à l'aide de spectres Raman, un modèle CNN basé sur le réseau VGG-16 a été utilisé. L'architecture du modèle se composait de 13 couches de convolution unidimensionnelles, de 5 couches de regroupement et de 3 couches entièrement connectées (comme illustré à la Fig. 2h), utilisant un empilement de noyaux de convolution à petite échelle plutôt que des noyaux de convolution à grande échelle pour réduire les paramètres requis pour calculs36. Une base de données Raman de tissus hépatiques a été établie avec 50 spectres par échantillon de tissu, et un total de 12 000 spectres ont été obtenus à partir de 120 paires d'échantillons de tissus hépatiques. Les données spectrales allaient de 500 à 2000 cm−1 avec 889 données flottantes unidimensionnelles. Un modèle de classification binaire a été construit pour classer les tissus cancéreux du foie et les tissus paracancer, qui ont été désignés 1 et 0, respectivement. Les données spectrales ont été prétraitées avec une soustraction et un lissage de base, puis introduites dans le modèle CNN avec un mélange aléatoire. La fonction softmax a été utilisée comme fonction d'activation dans la couche de sortie, qui génère les probabilités de deux classes avec la valeur la plus élevée considérée comme la classe prédite.

La précision et la perte d'entropie croisée sont deux indicateurs souvent utilisés pour évaluer les performances et la fiabilité des modèles CNN. Avec les itérations d'apprentissage, les courbes de précision et de perte d'entropie croisée de l'ensemble de validation tendent progressivement à converger, indiquant que le modèle n'est pas sur-ajusté (Fig. 2i, j). En conséquence, une précision de 92,6 % a été obtenue pour l'estimation de la surface du tissu carcinome, accompagnée d'une sensibilité et d'une spécificité de 90,8 % et 94,6 %, respectivement.

De plus, trois autres modèles CNN ont été établis pour distinguer les tissus HCC des tissus ICC, et parmi les tissus avec différents stades de cancer et degrés de différenciation. Les performances de quatre modèles binaires sont présentées dans les matrices de confusion de la figure 2k. L'hétérogénéité tumorale a posé un défi dans la discrimination des différents stades et degrés de différenciation des tissus tumoraux, avec des précisions de 78,3 % et 72,3 %, respectivement. Mais un meilleur résultat a été obtenu pour la classification des sous-types de cancer du foie HCC et ICC, donnant une précision d'identification de 82,4 %. Quatre courbes de caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC) ont été tracées pour vérifier quantitativement les performances des classificateurs (Fig. 2l), avec des valeurs d'aire sous la courbe (AUC) comprises entre 0, 783 et 0, 965. De plus, par rapport à d'autres algorithmes d'apprentissage automatique courants, y compris PLS-DA, forêt aléatoire et XGBoost, l'approche d'apprentissage en profondeur montre des performances de calcul supérieures avec une plus grande précision dans l'identification des tissus de différents types pathologiques, en particulier dans le traitement des données déséquilibrées (tableau supplémentaire 3 ).

Il convient de noter que le diagnostic conventionnel du CHC basé sur un seul biomarqueur sérologique (tel que l'AFP) a atteint une faible sensibilité dans cette étude. À un seuil d'AFP de 200 ng/ml, 25 des 92 patients atteints de CHC étaient positifs, avec une sensibilité de seulement 27,2 % (Fig. 5 supplémentaire), bien inférieure à notre méthode basée sur des mesures Raman. En outre, les modalités d'imagerie telles que la tomodensitométrie et l'IRM sont recommandées comme méthodes de diagnostic de première intention pour identifier ou prédire différents états pathologiques du CHC37,38. Par exemple, la stadification clinique du CHC est principalement diagnostiquée sur la base des caractéristiques d'imagerie, y compris le nombre et la taille des nodules de CHC, et la présence d'une invasion vasculaire. Ici, les spectres Raman ont également montré la faisabilité de la détermination de l'invasion microvasculaire avec une précision de 67% et une valeur AUC de 0, 694 sur la base de 84 patients (Fig. 6 supplémentaire). Les résultats peuvent être améliorés avec une augmentation supplémentaire du nombre d'échantillons et des collections spectrales. En somme, en termes de précision, la spectroscopie Raman est comparable ou meilleure que les modalités d'imagerie traditionnelles (telles que la tomodensitométrie, l'IRM et les États-Unis) pour identifier différents types de pathologies dans l'étude actuelle (tableau supplémentaire 4), fournissant un complément puissant aux méthodes existantes. techniques de diagnostic de la pathologie.

Afin de confirmer davantage les changements dans la composition biochimique des tissus cancéreux du foie, une stratégie métabolomique non ciblée a été employée, basée sur la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). La métabolomique tissulaire est largement utilisée dans l'étude de la pathogenèse de la maladie en fonction des caractéristiques métaboliques39,40, qui peuvent fournir des informations directes sur les altérations métaboliques aux sites ciblés et révéler des biomarqueurs tumoraux pertinents. Un total de 25 paires de tissus HCC appariés et de tissus non tumoraux adjacents ont été évalués dans cette étude. Les ions 1995 et 2228 ont été retenus dans les modes de source d'ionisation électrospray positive et négative (ESI + et ESI−), respectivement (données supplémentaires 1), après suppression de l'écart et des valeurs manquantes. Au total, 57 métabolites en mode ESI+ et 51 en mode ESI− ont été identifiés et sélectionnés comme métabolites différentiels candidats (Données supplémentaires 2). Les différences entre neuf types de métabolites primaires et la carte thermique regroupée hiérarchiquement de 108 biomarqueurs métaboliques spécifiques entre les tissus HCC et les tissus non tumoraux adjacents ont été tracées sur les figures 3a et b. La plupart des métabolites présentaient une tendance à la baisse dans les tissus HCC, ce qui est cohérent avec la plus faible intensité Raman dans les tissus HCC.

a Distributions de l'abondance relative pour neuf types de métabolites différentiels entre les échantillons de tissus de CHC et les échantillons de tissus non tumoraux adjacents appariés, en tant que rapport à l'abondance relative médiane dans les tissus non tumoraux. i–ix représentent les métabolites de la tyrosine (i), les acides aminés non aromatiques (ii), les acides gras (iii), les PC marqués avec les PUFA (iv), les PC marqués avec les SFA et les MUFA (v), les carnitines (vi), les nucléosides (vii), des bases et leurs dérivés (viii), et des saccharides (ix). b Carte thermique regroupée de manière hiérarchique de 108 métabolites significativement différents entre les tissus HCC et les tissus non tumoraux adjacents en fonction de la distance euclidienne. Les blocs ont été colorés en fonction des niveaux d'expression relatifs des métabolites. Le violet indique une expression élevée ; l'orange clair indique une faible expression. c Teneur différentielle en acides aminés aromatiques (phénylalanine, tyrosine et tryptophane) entre les tissus HCC et les tissus non tumoraux adjacents. Une augmentation significative de la tyrosine a été observée dans le groupe paracancer (test t de Student bilatéral, P < 0,05), et des niveaux plus élevés de tryptophane et de phénylalanine ont également été observés, mais les changements n'étaient pas significatifs (test t de Student bilatéral , P > 0,05). Les boîtes à moustaches montrent les quartiles moyen, médian et inférieur/supérieur ; les moustaches montrent des clôtures intérieures. d Teneur en phosphatidylcholines représentatives (i), nucléosides, bases et saccharides (ii) avec des différences significatives entre les tissus HCC et les tissus adjacents. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET. Tissus HCC, n = 25, tissus adjacents, n = 25. Les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data.

Par exemple, une régulation négative significative de la tyrosine a été observée dans les tissus HCC, tandis que les deux autres acides aminés aromatiques (ArAA), la phénylalanine et le tryptophane, n'ont pas subi de changements significatifs (Fig. 3a (i) et Fig. 3c). Cependant, nous avons constaté des diminutions d'autres composés aromatiques dans les tissus HCC, notamment la dopa, l'acide 3-hydroxyanthranilique et l'aniline, ce qui suggère que les variations des bandes Raman liées au cycle benzénique des tissus hépatiques pourraient également provenir de dérivés d'ArAA ou d'autres métabolites aromatiques. De plus, la plupart des AA non aromatiques, tels que la β-alanine, la glycine, l'asparagine, le glutathion et la thréonine, ont également diminué dans les tissus HCC (Fig. 3a (ii)). Cependant, l'arginine a augmenté dans le groupe HCC, ce qui pourrait être attribué à la suppression de l'arginase I (ARG1), une enzyme dégradant l'arginine, et l'arginine a également été signalée comme favorisant la croissance tumorale41.

Le foie est le principal site de synthèse des lipides et des acides gras. Une lésion des hépatocytes peut altérer la fonction hépatique et entraîner un dysfonctionnement du métabolisme des lipides42. Par exemple, à l'exception de l'acide eicosadiénoïque et de l'acide nervonique, la plupart des acides gras, en particulier les acides gras polyinsaturés (AGPI), sont régulés à la baisse dans les tissus HCC (Fig. 3a (iii)). En outre, la phosphatidylcholine (PC) est un composant important des membranes cellulaires et peut être oxydée par des espèces réactives de l'oxygène43. Dans cette étude, les niveaux de PC marqués avec des PUFA ont été significativement réduits dans le groupe HCC (Fig. 3a (iv)), ce qui pourrait être attribué à l'oxydation des PUFA en présence d'un stress oxydatif élevé dans les tissus cancéreux, entraînant une augmentation supplémentaire des PC marqués avec des acides gras saturés (SFA) ou des acides gras monoinsaturés (MUFA) (Fig. 3a (v) et Fig. 3d (i)). De plus, des augmentations des acylcarnitines à longue chaîne et des diminutions des acylcarnitines à chaîne courte ou moyenne, telles que la propionylcarnitine et l'hexanoylcarnitine, ont été observées (Fig. 3a (vi)).

Les hépatocytes jouent un rôle essentiel et sont généralement impliqués dans le métabolisme des nucléotides. Des troubles de certains nucléosides, bases et métabolites associés ont également été observés (Fig. 3a (vii – viii)), principalement liés au métabolisme des purines. Les métabolites puriques participant aux synthèses d'ADN et d'ARN sont essentiels à la promotion de la survie et de la prolifération cellulaire44. À l'exception de l'inosine, la plupart des métabolites puriques ont montré une régulation à la baisse dans le groupe HCC, y compris la xanthine, l'hypoxanthine, la xanthosine, la désoxyinosine, l'uridine, l'acide urique et l'adénine (Fig. 3d (ii)), ce qui peut être attribué à une diminution de l'activité des molécules apparentées. enzymes métaboliques45.

La plupart des saccharides et des métabolites apparentés, tels que le d-ribose, le d-sédoheptulose, l'acide d-glucuronique, le d-tagatose et le saccharose, étaient significativement régulés à la baisse dans les tissus HCC (Fig. 3a (ix) et d (ii)). Cependant, un niveau élevé du métabolite de la glycolyse glucose 6-phosphate a été observé dans le groupe HCC, tandis que les métabolites du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA), y compris l'acide fumarique et l'acide succinique, étaient régulés à la baisse, comme indiqué précédemment46. Les modifications de ces métabolites liés à l'énergie suggèrent une dépense rapide de glucose via une augmentation de la glycolyse aérobie dans les cellules cancéreuses, ce qui pourrait être dû à l'effet Warburg47.

De plus, il a été observé que plusieurs métabolites augmentaient de manière significative dans les tissus du CHC, notamment le glutathion, la 5'-méthylthioadénosine, l'acide 3,4,5-triméthoxycinnamique, l'acide oxoadipique et la 2-oxoarginine, qui ont le potentiel d'être des biomarqueurs du cancer du foie. dépistage (Fig. 3b et données supplémentaires 2). Pour comparer les différences de métabolites ci-dessus de manière plus intuitive, la représentation des changements relatifs des échantillons de HCC sur les tissus adjacents respectifs est illustrée à la Fig. 7 supplémentaire. des tissus adjacents non tumoraux. La précision est comprise entre 70 % et 80 %, ce qui est inférieur aux résultats de l'analyse spectrale, mais la précision peut être améliorée en augmentant le nombre d'échantillons.

En raison de l'hétérogénéité des tissus tumoraux et des différences entre les patients, les écarts dans les données Raman entre les échantillons de tissus sont inévitables (Fig. 2 supplémentaire), ce qui est difficile pour la discrimination globale des différents tissus. Cependant, pour le cancer du foie apparié et les tissus non tumoraux adjacents du même patient, des différences d'intensité Raman ont été facilement observées dans la plupart des échantillons. Par conséquent, nous suggérons que la technologie de spectre sans étiquette décrite ici puisse incorporer des algorithmes d'analyse d'image appropriés pour visualiser les marges du cancer et faciliter la délimitation peropératoire de la tumeur.

Afin de tester cela, deux blocs de tissus de cancer du foie ont été sélectionnés pour le balayage Raman. Comme le montrent les figures 4a et b, les deux blocs de cancer du foie et les images colorées H&E correspondantes ont validé l'existence d'une cancérisation des hépatocytes dans laquelle le cordon hépatique présentait un arrangement désordonné avec une densité cellulaire et un rapport nucléaire / cytoplasmique accrus. Les images en fond clair de la région de test de cartographie des tissus cancéreux du foie sont présentées à la Fig. 4c. La technologie LiveTrack a été utilisée pour ajuster en continu la hauteur de l'échantillon afin de garder l'échantillon net. Les données de hauteur de surface ont été enregistrées pendant les mesures Raman, et des images de profil de surface tridimensionnelles (3D) des deux échantillons de tissu sont présentées à la Fig. 4c, avec des différences de hauteur maximales de 38, 2 et 27, 4 µm, respectivement. Les images Raman ont été analysées avec des algorithmes de résolution de courbe d'auto-modélisation (SMCR) et d'analyse de cluster hiérarchique (HCA). La méthode SMCR pourrait résoudre l'ensemble de données de cartographie Raman inconnu dans les spectres de composants purs, produisant des images de concentration et un spectre pur simultanément (comme décrit dans la section "Méthodes"). Des images de haute qualité ont été obtenues sur la base de la méthode SMCR (Fig. 4d). Une bordure distincte de la région cancéreuse a pu être observée dans le premier échantillon de tissu, où les régions du carcinome et du parenchyme hépatique ont été distinguées avec succès, comme indiqué dans différentes pseudo-couleurs. Les limites tumorales n'étaient pas lisses dans l'imagerie Raman (Fig. 4d et e, panneau supérieur), probablement en raison de la mince capsule tumorale et de la petite zone d'imagerie (50 × 50 μm) avec un intervalle de balayage à l'échelle du micron (2 μm). Le deuxième tissu présentait une bordure relativement pauvre de cancer dans la zone affichée (Fig. 4d et e, panneau inférieur), se mêlant au parenchyme hépatique, probablement en raison de la présence d'une infiltration cancéreuse, à peine détectable sur les images en fond clair. Ces lésions cancéreuses ont été confirmées par coloration H&E (Fig. 4b). HCA était une autre méthode chimiométrique utilisée ici pour combiner un ensemble de spectres en grappes avec des spectres similaires d'une manière plus abstraite. Les résultats des images dérivées de HCA (Fig. 4e) sont cohérents avec ceux traités avec SMCR (Fig. 4d), indiquant la fiabilité des algorithmes de traitement d'image.

a Photographies de deux blocs de cancer du foie sélectionnés ; les flèches pointent vers les positions des régions d'imagerie Raman. b Les images colorées H&E locales des deux tissus hépatiques et les cases blanches de la rangée du bas sont les zones d'imagerie Raman approximatives. c Images en fond clair (50 × 50 µm) de la région de test de cartographie (à gauche) et images de profil de surface 3D correspondantes construites avec la technologie LiveTrack (à droite) de deux échantillons. d, e Les images Raman dérivées du SMCR (d) et dérivées du HCA (e) montrent des marges de cancer pour les échantillons de tissu hépatique. f Spectres typiques collectés aux points 1 à 8 indiqués en (d); les points 1, 2, 5 et 6 proviennent des régions putatives de paracarcinome ou non tumorales et 3, 4, 7 et 8 proviennent des régions putatives de carcinome. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour démontrer davantage la variation spectrale dans différentes régions de surface du tissu hépatique, nous avons collecté des spectres (Fig. 4f) à partir de plusieurs emplacements marqués de pointes de flèches sur la Fig. 4d. Les points 1, 2, 5 et 6 ont été collectés dans des régions putatives de paracarcinome et non tumorales et présentaient une intensité Raman plus élevée que celles collectées dans des régions putatives de carcinome (points 3, 4, 7 et 8) dans les deux blocs de tissus. Cette différence de signature Raman fournit une base pour la reconnaissance de l'algorithme d'image, soutenant notre attente initiale d'une détection de marge tumorale de haute précision à l'aide de la technique Raman. De plus, des images Raman plus grandes peuvent également être obtenues en utilisant un objectif à faible grossissement et/ou en augmentant l'intervalle de balayage à l'aide du puissant algorithme d'image (Fig. 8 supplémentaire).

Pour vérifier les capacités clinicopathologiques et diagnostiques de la spectroscopie Raman, nous avons utilisé un spectromètre micro-Raman pour imager des tranches de tissu hépatique humain non colorées d'une épaisseur de 5 µm. Nous avons d'abord acquis des spectres originaux dans la gamme de 2000 à 3400 cm−1 (Fig. 5a). Les spectres tissulaires contenaient un pic proéminent à 2930 cm-1, qui est lié à l'étirement du CH3 dans les protéines48. De plus, plusieurs pics Raman caractéristiques liés aux lipides à 2855, 2885 et 3007 cm−1 ont été détectés, qui ont été attribués à la vibration CH2 symétrique des lipides, à la résonance de Fermi ou à la vibration asymétrique du CH2 dans les longues chaînes acyle droites saturées et à la vibration insaturée. =CH s'étire dans les chaînes acyle, respectivement49. L'acquisition d'images Raman en mode StreamHR a été réalisée sur le cancer du foie non coloré et les coupes de tissus adjacents à une résolution de 0,8 µm dans les deux directions axiales. Une analyse multivariée a été effectuée sur les données de cartographie Raman pour reconstruire des cartes de distribution spatiale des principaux composants chimiques des tissus. Les spectres Raman des protéines pures et des lipides ont également été résolus par l'algorithme SMCR (Fig. 5a). Les cartes de concentration reconstruites par SMCR des protéines et des lipides dans le tissu hépatique normal sont présentées sur les figures 5b et c, respectivement. Pour mieux comprendre leur distribution spatiale relative, une image superposée en couleur des deux est illustrée à la Fig. 5d.

un spectre Raman typique de tranches de tissu hépatique dans la plage de 2 000 à 3 400 cm-1 (ligne violette) ; les spectres Raman des protéines pures (ligne bleue) et des lipides (ligne jaune) sont également résolus par l'algorithme SMCR. Le pic Raman à 2930 cm-1 (flèche 3) est lié à la protéine, et les pics autour de 2855 cm-1 (flèche 1), 2885 cm-1 (flèche 2) et 3007 cm-1 (flèche 4) sont caractéristiques de lipides. b – d Cartes de concentration reconstruites par SMCR des lipides (b) et des protéines (c) dans le tissu hépatique normal ; d est une superposition des deux. Pour fusionner les deux images, la valeur LUT minimale de jaune (lipides) a été ajustée. e–i Images en fond clair de la zone de test de cartographie et Raman correspondant coloré par H&E, dérivé du SMCR, et images de profil de surface 3D correspondantes du tissu hépatique normal (e). f–i montrent d'autres régions tissulaires avec des morphologies typiques, y compris la cancérisation (f), la stéatohépatite (g), la fibrose (h) et les tissus conjonctifs (i). Toutes les barres d'échelle sont de 10 µm.

Ensuite, les images Raman du parenchyme hépatique normal typique (Fig. 5e) et des zones cancéreuses (Fig. 5f) ont été comparées. Les images Raman superposées des protéines et des lipides et les images de profil de surface 3D correspondantes, les images en fond clair et les images colorées H&E de la zone de test sont illustrées aux Fig. 5e et f. Les images dérivées de l'algorithme SMCR présentaient une structure sous-cellulaire claire en pseudo-couleur, révélant des variations de concentration en lipides et en protéines. Dans le tissu hépatique normal, les protéines étaient à des concentrations plus élevées dans la région nucléaire et les lipides étaient principalement distribués dans les régions périphériques des cellules hépatiques. Alors que dans les cellules cancéreuses, les protéines sont principalement distribuées près de la membrane cellulaire avec moins de cellules à l'intérieur. Il convient de noter que de telles différences dans la distribution spatiale des composants biochimiques sont généralement difficiles à discerner dans les images colorées par H&E. De plus, des changements typiques au cours de la transformation des cellules cancéreuses, tels que la disposition irrégulière des hépatocytes et un rapport nucléaire/cytoplasmique plus important, ont également été observés dans les images Raman, compatibles avec les champs lumineux et la coloration H&E. En plus de l'imagerie planaire, des images de profil de surface 3D ont été obtenues, qui combinaient des informations sur la composition chimique avec la topographie de la surface des tissus.

En plus des tissus normaux et cancéreux, des scans Raman ont été effectués sur plusieurs autres régions tissulaires avec des morphologies typiques, notamment la stéatohépatite, les tissus fibrotiques et conjonctifs (Fig. 5g – i). Ces images Raman présentaient diverses caractéristiques morphologiques des cellules et des tissus, telles que des gouttelettes de graisse et des fibres de filaments, qui étaient en accord avec les images en fond clair et colorées correspondantes. Toutes les cartes de concentration individuelles reconstruites par SMCR des protéines et des lipides dans les tranches de tissu sont présentées dans la Fig. 9 supplémentaire. par spectroscopie Raman. La Fig. 10 supplémentaire montre des images 3D reconstruites des cinq tranches de tissu de la Fig. 5. Les images ont été reconstruites à partir d'une pile de six tranches z (tranches de 5 µm), chaque plan couvrant 50 µm × 3 µm, ce qui a fourni une profondeur histochimique plus abondante. informations sur les échantillons de tissus. Dans cette étude, la profondeur de détection maximale du tissu hépatique par spectroscopie Raman confocale sous un laser de 532 nm était d'environ 200 µm (Fig. 11 supplémentaire). Pour une détection plus profonde des tissus, l'intégration de la spectroscopie Raman spatialement décalée (SORS) peut être appliquée pour obtenir une détection de profondeur centimétrique50.

Après avoir validé les performances de la spectroscopie Raman dans le diagnostic et l'imagerie du tissu hépatique in vitro, nous avons étudié plus avant sa faisabilité pour le diagnostic peropératoire du cancer du foie en temps réel. Un système de spectroscopie Raman portatif sur mesure a été utilisé en peropératoire pour détecter le carcinome hépatique. Le système était composé d'un laser couplé à la fibre à 785 nm, d'une sonde portative et d'un spectromètre à fibre (détails décrits dans la section "Méthodes"). Le spectromètre était connecté à un ordinateur personnel avec un logiciel d'acquisition, produisant des informations sur le contenu moléculaire du tissu ciblé. Pendant le fonctionnement, la sonde était également recouverte d'une housse de protection stérile jetable, qui avait un effet négligeable sur le spectre Raman mesuré (Fig. 12 supplémentaire).

La figure 6 montre les spectres Raman moyens du tissu hépatique obtenus à partir de mesures peropératoires in vivo. La sonde a été maintenue au-dessus de la surface du tissu pour mesurer les signaux Raman en plusieurs points choisis au hasard dans le carcinome et les régions non tumorales adjacentes. L'intensité spectrale Raman totale de la région non tumorale était significativement plus élevée que celle de la région tumorale. Ceci est cohérent avec les résultats des tests in vitro, bien qu'il existe une différence entre les spectres tissulaires collectés par le spectromètre Raman portable et le spectromètre micro-Raman (Fig. 13 supplémentaire). Les principales différences spectrales entre les régions tumorales et non tumorales se situent sur les pics liés aux protéines à 640, 976, 1024, 1540 et 1635 cm−1, les pics liés aux lipides à 413, 775, 1314, 1381 et 1436 cm− 1, et des pics associés aux acides nucléiques à 689, 1094 et 1514 cm-1. Au fur et à mesure que davantage de données spectrales peropératoires sont acquises, ces différences spectrales combinées à des algorithmes appropriés peuvent aider à distinguer les régions tumorales et parenchymateuses hépatiques en chirurgie, et d'autres techniques de cartographie Raman peropératoires peuvent rendre possible la visualisation des limites tumorales.

Les spectres Raman moyens des mesures peropératoires in vivo pour les tissus de carcinome et de paracarcinome ont été recueillis chez six patients. Les spectres ont été collectés par un système de spectromètre Raman portable équipé d'un laser NIR à 785 nm et d'un spectromètre CCD informatisé. Les zones ombrées représentent les écarts-types des moyennes. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

La spectroscopie Raman a le potentiel d'être un outil polyvalent pour le diagnostic histopathologique du cancer du foie car elle permet une détection rapide et une spécificité chimique élevée basée sur des signaux de vibration moléculaires intrinsèques. Plus précisément, les spectres du cancer du foie ont montré une intensité globale plus faible que ceux collectés à partir de tissus non tumoraux adjacents, et différents modèles Raman ont également été observés dans divers tissus pathologiques, ce qui reflète la complexité du métabolisme biochimique dans la progression du cancer du foie51. Pour confirmer les différences de ces composants biochimiques entre les tissus HCC et les tissus adjacents, une analyse métabolomique a été réalisée sur la base de LC-MS, révélant que la plupart des métabolites présentaient une tendance à la baisse dans les tissus HCC, tels que la plupart des acides aminés, des lipides et des acides nucléiques, tandis que Les PC marqués avec des SFA ou des MUFA ont augmenté. Le résultat était cohérent avec celui de l'analyse Raman, démontrant que la métabolomique basée sur Raman, également connue sous le nom de Ramanomics52, pouvait apporter des informations biologiques complètes et fiables en tant que métabolomique traditionnelle, et distinguer les différents tissus pathologiques de manière plus pratique et plus rentable sans consommables supplémentaires.

En outre, un modèle CNN basé sur VGG-16 a été construit et utilisé avec succès dans la distinction entre les spectres Raman collectés à partir de tissus de carcinome hépatique et de tissus non tumoraux adjacents et la reconnaissance de différents tissus pathologiques hépatiques, y compris différents sous-types, stades tumoraux et différenciations. Les résultats ont démontré que la spectroscopie Raman combinée à l'apprentissage en profondeur peut enregistrer et identifier avec précision les modèles spectraux dans différents échantillons pathologiques. De plus, nous prévoyons également d'étudier la discrimination des précurseurs du CHC et des lésions hépatiques non malignes dans le travail de suivi, ainsi que la distinction entre le cancer du foie primitif et secondaire, qui est cruciale pour le traitement et le pronostic du carcinome hépatique.

Sur la base des différences spectrales Raman, la morphologie cellulaire des tranches de tissu peut être représentée sans étiquette. Les images Raman résolues par SMCR pourraient non seulement montrer des distributions spatiales, mais également une identification quantitative des principaux composants biochimiques (protéines et lipides) des cellules et des tissus à des échelles subcellulaires 2D et 3D, qui ne sont pas applicables par les méthodes de coloration H&E standard. Cela indique que l'analyse Raman subcellulaire a un grand potentiel pour simplifier le diagnostic du cancer lors des essais cliniques et offre une perspective sur le diagnostic histopathologique.

Cliniquement, la résection chirurgicale est une méthode standard pour le traitement du cancer. L'identification précise des limites tumorales est utile pour la résection complète des lésions sans résection excessive des tissus normaux, en particulier pour la résection des métastases hépatiques. Cependant, c'est souvent un défi pour les chirurgiens sans méthodes peropératoires appropriées pour distinguer visuellement les deux tissus. Nous avons utilisé la spectroscopie Raman dans les mesures ex vivo et in vivo pour les tissus hépatiques caractérisés par différents modèles pathologiques. Les images acquises avec des marges cancéreuses distinctes étaient visibles sur la base des différences de spectres entre les régions tumorales et parenchymateuses hépatiques. En outre, nous avons vérifié avec succès la faisabilité du spectromètre Raman portable pour distinguer les tumeurs des régions non tumorales pendant la chirurgie. Ceux-ci suggèrent que la technique Raman a le potentiel d'aider les chirurgiens à analyser rapidement les régions d'intérêt pendant la chirurgie, sans perturbations ni retards dus à la coupe congelée peropératoire ou à la coloration H&E53.

Il convient de noter que les spectres Raman des tissus collectés par le spectromètre Raman portable diffèrent de ceux obtenus à partir du spectromètre micro-Raman, en particulier à certaines positions de pic (Fig. 13 supplémentaire). Cela peut être attribué aux différences entre les deux types d'équipements spectraux, tels que les sources laser, la puissance et la longueur d'onde du laser et le spectromètre. Un résultat similaire a également été observé dans une détection Raman de tumeurs de souris par un dispositif Raman portable54. Cependant, bien qu'il y ait eu des différences dans les données Raman mesurées par les deux équipements, cela n'a pas affecté la capacité de la spectroscopie Raman à distinguer les tissus cancéreux des tissus normaux adjacents.

De plus, l'application pratique de la spectroscopie Raman en tant qu'outil clinique nécessite encore une exploration et une optimisation plus poussées. Dans cette recherche, le signal Raman dérivé des blocs de tissu hépatique est suffisamment élevé pour être détecté pour le diagnostic. Ainsi, aucune nanoparticule métallique n'était nécessaire pour l'amélioration du signal Raman, évitant ainsi le risque de toxicité et d'excrétion des particules métalliques dans les applications cliniques55,56. Cependant, l'un des principaux défauts de la spectroscopie Raman spontanée est l'intensité du signal relativement faible, nécessitant un compromis entre qualité d'image et temps d'acquisition court. Cela pourrait être résolu en combinant la spectroscopie Raman cohérente, qui est basée sur des effets optiques non linéaires et peut être utilisée simultanément pour une vitesse élevée et une résolution spatiale élevée dans l'imagerie spectrale Raman48,57. De plus, les points de collecte spectraux limités avec la sonde Raman portable peuvent entraîner des lésions manquantes pendant la chirurgie, tandis que les fluctuations respiratoires peuvent affecter la qualité spectrale même si le temps d'intégration Raman est plus de 10 fois plus court que la période respiratoire. Nous espérons démontrer qu'un système de collaboration robotique intelligent peut être utilisé pour aider à l'imagerie Raman peropératoire afin de résoudre ces problèmes dans notre travail de suivi. De plus, le développement d'équipements de diagnostic portables intégrés a permis l'élimination précise des régions d'intérêt d'une manière plus pratique pendant la chirurgie du cancer58. Cependant, avec l'émergence de ces nouveaux instruments, la normalisation des instruments pour tous les utilisateurs est également préoccupante29, et des facteurs tels que la longueur d'onde d'excitation, la puissance du laser, le type de collecteur de spectre, ainsi que les algorithmes de traitement des données, devraient être normalisés. Par conséquent, on espère qu'un système de spectroscopie Raman pratique avec un critère de normalisation pour un diagnostic précis sera bientôt développé pour faciliter son adoption clinique.

Bien que les travaux actuels aient été menés dans le contexte du carcinome hépatique, la même approche pourrait être utilisée pour évaluer des caractéristiques histologiques similaires de tumeurs dans d'autres organes. Ainsi, nous concluons que la technique Raman, couplée à des algorithmes intelligents, pourrait être appliquée pour le diagnostic du foie et d'autres types de tumeurs, jouant un rôle potentiel dans l'identification pathologique et le guidage peropératoire.

Toutes les méthodes de recherche actuelles ont été menées conformément aux directives approuvées par le comité d'éthique du premier hôpital affilié de l'université médicale de Wenzhou (approbation éthique n° 2020213). Un consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les patients pour lesquels les risques et les bénéfices de l'essai ont été détaillés.

Dans la présente étude, un total de 240 échantillons de tissus avec un cancer du foie apparié et des blocs de tissus non tumoraux adjacents ont été obtenus de 120 patients atteints d'un cancer primitif du foie, dont 98 personnes ont reçu un diagnostic de carcinome hépatocellulaire (CHC) et 22 étaient un cholangiocarcinome intrahépatique. (CPI). Des informations détaillées sur les diagnostics cliniques et histopathologiques des 120 patients sont fournies dans le tableau supplémentaire 1. Les résultats diagnostiques des patients, y compris le type de cancer, le stade du cancer et le type de différenciation, ont été confirmés sur la base d'indicateurs cliniques et pathologiques connexes4 par des médecins du premier hôpital affilié. de l'Université médicale de Wenzhou.

Après résection chirurgicale et inspection, tous les échantillons ont été conservés au réfrigérateur à -80 °C. Avant les mesures spectrales, des blocs de tissu ont été placés sur une lame de verre et l'eau de la surface du tissu a été absorbée avec du papier de soie. Un traitement minimal des échantillons a été appliqué afin de faciliter une application ultérieure dans la détection et l'imagerie peropératoires. Les blocs de tissus prélevés sur les tissus cancéreux et les tissus non tumoraux adjacents ont été reconfirmés par des pathologistes sur la base de la coloration H&E.

Pour l'imagerie des tranches de tissu, les tranches de tissu d'une épaisseur de 5 µm ont été préparées à l'aide d'un microtome à congélation et les tranches ont été fixées sur des lames de verre pour les mesures Raman. Le même tissu a été observé par coloration H&E après mesures Raman.

Les spectres Raman d'échantillons de tissus ont été obtenus par un spectromètre micro-Raman (Renishaw, Gloucestershire, Royaume-Uni) en utilisant un laser d'excitation à 532 nm. Le faisceau laser a été focalisé sur la surface de l'échantillon par un objectif Lx50 (ouverture numérique (NA) = 0,50, distance de travail (WD) = 8,2 mm). Chaque spectre a été intégré sur 3 s à une puissance laser de 5 % (1,25 mW cm-2). Au moins 50 spectres compris entre 500 et 2000 cm-1 ont été collectés à partir de points sélectionnés au hasard sur la surface de chaque échantillon de tissu. Avant l'analyse statistique, les données spectrales ont été traitées à l'aide du logiciel WIRE 5.3 avec soustraction de ligne de base et lissage Savitzky – Golay pour supprimer le fond de fluorescence et augmenter le rapport signal sur bruit.

En imagerie Raman de blocs tissulaires pour la délimitation de la marge tumorale, des spectres Raman ont également été acquis avec un objectif L×50 (NA = 0,50, WD = 8,2 mm), équipé d'un laser de 532 nm, avec une puissance laser de 2,5 mW cm−2 et 2 s temps d'exposition pour chaque point de données. Les scans Raman ont été collectés avec une résolution de 2 μm dans les directions x et y (mode StreamHR), ce qui permet une collecte rapide des spectres à haute résolution spatiale. Pour éviter de compromettre la qualité de l'analyse Raman à fort grossissement en raison des surfaces inégales des échantillons de tissus pendant l'imagerie, la technologie de suivi de la mise au point LiveTrack a été utilisée pour se concentrer automatiquement sur la surface de l'échantillon pendant l'acquisition de l'image.

Dans l'imagerie Raman de tranches de tissu, les spectres Raman ont été acquis à une résolution plus élevée de 0, 8 μm dans les deux directions axiales, avec une puissance laser de 12, 5 mW cm-2 et un temps d'exposition de 0, 5 s pour chaque point de données. Les modes StreamHR et LiveTrack équipés d'un laser 532 nm et d'un objectif L×50 (NA = 0,50, WD = 8,2 mm) ont été utilisés comme ci-dessus pour une acquisition de données rapide et précise.

La résolution de courbe d'auto-modélisation du logiciel WiRE 5.3 (SMCR) et l'analyse de cluster hiérarchique (HCA) ont été utilisées pour l'analyse par imagerie Raman des marges tumorales. Les spectres ont été prétraités par correction de la ligne de base, lissage, suppression des rayons cosmiques et filtrage du bruit avant toute autre imagerie multivariée.

Un système de spectroscopie Raman portable a été utilisé dans la détection peropératoire du cancer du foie. Un laser couplé à une fibre à 785 nm (FC-D-785, Changchun New Industries Optoelectronics Technology Co., Ltd., Chine) a été utilisé comme source laser, qui a été introduit dans une sonde portable connectée à une fibre de 100 µm pour laser excitation et une fibre standard de 200 µm pour la collecte du signal (NA = 0,22). Les signaux Raman ont été collectés avec un spectromètre à fibre basé sur un dispositif à couplage de charge (CCD) (QE Pro, Ocean Optics Inc., Dunedin, FL, USA) sur une plage spectrale de 200–1100 nm et une résolution de 6–7 cm−1 . Les spectres couvraient une large gamme de décalages spectraux de 0 à 4000 cm−1. Le spectromètre était connecté à un PC par une interface OceanView.

Pour éviter une infection peropératoire, la sonde Raman et la fibre connectée ont été essuyées avec de l'alcool médical et recouvertes d'une housse de protection stérile jetable en polyéthylène (Renhe Medical Supplies Industry and Trade Co., Ltd, Chun'an, Chine). Avant la mesure, la surface du tissu a été traitée pour minimiser le sang dans la zone testée. Un spectre de fond a d'abord été enregistré et soustrait automatiquement avant chaque mesure en utilisant un temps d'intégration de 0,2 s avec le laser éteint. Ensuite, cinq mesures ont été prises avec un temps d'intégration de 0,2 s à partir de points choisis au hasard sur chaque surface de tissu. La puissance laser à l'extrémité de la sonde était d'environ 40 à 56 mW cm-2, mesurée avec un wattmètre optique (PM100D de Thorlabs Inc.). Les tissus mesurés ont été prélevés pour une biopsie tissulaire par des pathologistes après la chirurgie.

Vingt-cinq paires de tissus HCC appariés et de tissus non tumoraux adjacents ont été sélectionnés pour détecter les différences métaboliques par LC-MS dans cette étude. Les méthodes spécifiques de traitement et de test des échantillons étaient les suivantes.

25 mg d'échantillon ont été pesés dans un tube Eppendorf et 500 μl de solution d'extrait (méthanol:acétonitrile:eau = 2:2:1) et un mélange d'étalons internes marqués isotopiquement ont été ajoutés. Ensuite, les échantillons ont été homogénéisés à 35 Hz pendant 4 min et soniqués pendant 5 min dans un bain d'eau glacée. Le cycle d'homogénéisation et de sonication a été répété trois fois. Ensuite, les échantillons ont été incubés à -40 ° C pendant 1 h puis centrifugés à 12 000 tr/min pendant 15 min à 4 ° C. Le surnageant résultant a été transféré dans un flacon en verre frais pour analyse. L'échantillon de contrôle qualité (CQ) a été préparé en mélangeant des aliquotes égales des surnageants de tous les échantillons.

Les analyses LC-MS/MS ont été réalisées à l'aide d'un système UHPLC (Vanquish, Thermo Fisher Scientific) avec une colonne UPLC BEH Amide (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm) couplée à un spectromètre de masse Q Exactive HFX (Orbitrap MS, Thermo). La phase mobile était constituée de 25 mmol/L d'acétate d'ammonium et de 25 mmol/L d'hydroxyde d'ammoniaque dans l'eau (pH = 9,75) (A) et d'acétonitrile (B). L'élution par gradient a été utilisée : 0 ~ 0,5 min, 95 % B ; 0,5 à 7 minutes, 95 % à 65 % B ; 7 à 8 minutes, 65 % à 40 % B ; 8–9 min, 40 % B ; 9–9,1 min, 40 %–95 % B ; 9,1–12 min, 95 % B. Le débit était de 0,5 ml/min. La température de l'échantillonneur automatique était de 4 ° C et le volume d'injection était de 2 μl.

Le spectromètre de masse QE HFX pourrait acquérir des spectres MS/MS en mode d'acquisition dépendant de l'information dans le contrôle du logiciel d'acquisition (Xcalibur, Thermo). Dans ce mode, le logiciel d'acquisition évalue en continu le spectre MS. Les conditions de la source ESI étaient les suivantes : débit de gaz gaine, 30 Arb ; Débit de gaz auxiliaire, 25 Arb ; température capillaire, 350 °C ; pleine résolution MS, 60 000 ; Résolution MS/MS, 7500 ; énergie de collision, 10/30/60 en mode NCE ; tension de pulvérisation, +3,6 ou -3,2 kV. La mesure a été réalisée avec le soutien de Shanghai Biotree Biotech Co., Ltd.

Les données brutes ont été converties au format mzXML à l'aide de ProteoWizard et traitées par un programme interne développé à l'aide de R et basé sur XCMS pour la détection, l'extraction, l'alignement et l'intégration des pics. L'identification des composés était basée sur le rapport masse sur charge des ions parents dans la spectrométrie de masse primaire et les ions produits caractéristiques générés par la fragmentation. Une base de données commerciale MS2 (BiotreeDB) a été utilisée pour annoter les métabolites. Le seuil d'annotation a été fixé à 0,6. Tous les ions détectés ont été normalisés selon des normes internes pour une analyse quantitative ultérieure. Les ions détectés par ESI+ et ESI− ont été importés dans le logiciel SIMCA (Umetrics, Umea, Suède) pour une analyse multivariée. Pour dépister les métabolites différentiels entre le CHC et les tissus non tumoraux adjacents, des ions avec des changements significatifs (test t de Student, P < 0,05), ainsi que des valeurs d'importance variable dans le projet (VIP) > 1 ont été sélectionnés dans le modèle OPLS-DA . Au final, 57 métabolites en mode ESI+ et 51 en mode ESI− ont été identifiés et sélectionnés comme métabolites différentiels candidats.

Les spectres Raman ont été analysés par PyTorch et l'architecture CNN a été modifiée sur la base du framework VGG-1636. Le modèle CNN a été construit avec 13 couches de convolution unidimensionnelles (dont 2 couches de convolution avec 64 noyaux, 2 couches de convolution avec 128 noyaux, 3 couches de convolution avec 256 noyaux et 2 ensembles de 3 couches de convolution avec 512 noyaux), 5 pooling couches (taille 2, foulée 2) et 3 couches entièrement connectées, comme illustré à la Fig. 2h.

Pour différencier les spectres des zones de tissus cancéreux et paracancéreux, un optimiseur soft-max a été utilisé pour transformer la sortie de la couche de connexion précédente en une sortie de probabilité, avec un taux d'apprentissage de 0,0001 et une taille de lot de 128. Pour éviter le surajustement, un la couche d'abandon a été utilisée avec un taux de 50 %, ce qui a annulé la contribution de 50 % des neurones vers la couche suivante pour réduire la dépendance excessive à certains neurones pour la classification. Les données spectrales de 20 paires d'échantillons de tissus hépatiques ont été sélectionnées au hasard comme ensemble de test, et les données spectrales des 100 paires d'échantillons restantes ont été divisées au hasard en un ensemble d'apprentissage et un ensemble de validation dans un rapport de 8:2. Des fractionnements similaires ont été effectués dans trois autres modèles de classification selon lesquels 20 % des échantillons de chaque groupe sont sélectionnés au hasard comme ensemble de test, et les échantillons restants sont divisés en ensemble d'apprentissage et en ensemble de validation selon le rapport de 9:1. L'équilibrage des poids a été utilisé pour atténuer les éventuels déséquilibres de données en modifiant le poids de chaque échantillon d'apprentissage lors du calcul de la perte pour que toutes les classes contribuent de manière égale à la perte (le détail du code peut être trouvé dans le lien GitHub suivant).

Les analyses de corrélation des intensités de pointe Raman représentatives basées sur le coefficient de corrélation de Pearson (r) sous la forme d'une carte thermique de la matrice de corrélation ont été calculées par Python. La version du logiciel utilisé pour analyser les données est la suivante : Python 3.9.9, pytorch 1.10.1, numpy 1.22.0, matplotlib 3.5.1, torchvision 0.11.2, tqdm 4.62.3, pandas 1.0.4 et seaborn 0.9 .0.

Les données sont exprimées en moyenne ± écart type (ET) comme indiqué dans la légende de chaque figure. Toutes les données sont conformes à la distribution normale. La signification statistique entre les deux groupes a été obtenue par un test t de Student bilatéral avec des valeurs de P < 0,05 considérées comme significatives. Les micrographies des images de coloration et des images Raman sont représentatives de trois mesures indépendantes.

L'algorithme SMCR a été utilisé dans l'analyse d'imagerie Raman de tranches de tissu pour identifier divers modèles histopathologiques hépatiques. La méthode SMCR est une forme de détermination de courbe multivariée et d'analyse alternée des moindres carrés, qui transforme les informations sur les composants en composants physiquement significatifs. Brièvement, SMCR décompose la matrice de données expérimentales (X), contenant toutes les données spectrales pour chaque pixel, en deux matrices plus petites, la matrice d'imagerie de concentration (C) et la matrice du spectre pur (S) :

où E est la matrice d'erreur. En estimant initialement la matrice spectrale S, C et ST peuvent être calculés, puis une optimisation itérative utilisant l'algorithme alternatif des moindres carrés (ALS) peut être effectuée jusqu'à ce que la convergence soit atteinte59.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui des résultats de cette étude sont disponibles dans le manuscrit et ses informations supplémentaires. Les données brutes de spectrométrie de masse associées à ce manuscrit se trouvent dans les données supplémentaires 1 et 2. Alors que la base de données commerciale MS2 (BiotreeDB) doit être obtenue en contactant Biotree Biotech Co., Ltd. Les données sources sont fournies avec cet article.

Le code utilisé pour le modèle CNN et les ensembles de données de démonstration est disponible sur https://github.com/thidoiSanren/CNN_liver-cancer_Raman60.

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Ce travail a été soutenu financièrement par la Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. LR19H180001) à YW, Leading Talent Innovation and Entrepreneurship Project of Wenzhou (RX2016005) à YW, et Public Projects of Wenzhou (2020005) à YW

École de génie biomédical, École d'ophtalmologie et d'optométrie, Hôpital ophtalmologique, Université médicale de Wenzhou, 325001, Wenzhou, République populaire de Chine

Liping Huang, Liangbin Sun, Yuzhe Chen, Xueqian Ren, Yuancai Ge, Xiaohu Liu et Yi Wang

Centre de recherche en ingénierie des matériaux fonctionnels cliniques et des dispositifs de diagnostic et de traitement de la province du Zhejiang, Institut de Wenzhou, Université de l'Académie chinoise des sciences, 325001, Wenzhou, République populaire de Chine

Liping Huang, Danfeng Jiang, Qingwen Zhang et Yi Wang

Le premier hôpital affilié de l'Université médicale de Wenzhou, 325015, Wenzhou, République populaire de Chine

Soleil de Hongwei et Shi de Keqing

Institut autrichien de technologie, Giefinggasse 4, Vienne, 1210, Autriche

Mont Wolfgang

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LH, QZ et YW ont conçu et réalisé l'étude. HS et KS ont fourni des échantillons cliniques et ont aidé à la coloration des tissus et à l'opération peropératoire. LS, YC et YG ont effectué des analyses statistiques et établi les modèles CNN. XR et DJ ont aidé LP avec la préparation des tissus et le test Raman. LP était responsable du traitement des données et des graphiques. LH, XL et QZ ont rédigé le manuscrit. WK, QZ et YW ont supervisé le projet. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Qingwen Zhang ou Yi Wang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Wei Min et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Huang, L., Sun, H., Sun, L. et al. Diagnostic histopathologique rapide et sans étiquette du cancer du foie basé sur la spectroscopie Raman et l'apprentissage en profondeur. Nat Commun 14, 48 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35696-2

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Reçu : 02 mars 2022

Accepté : 15 décembre 2022

Publié: 04 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-35696-2

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