La formation de nanofibres comme technologie prometteuse pour la conservation et le stockage facile des vésicules extracellulaires

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 22012 (2022) Citer cet article

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Les vésicules extracellulaires (EV) sont des particules membranaires d'origine cellulaire avec un potentiel pour un large éventail d'applications thérapeutiques futures. Cependant, les véhicules électriques ont presque toujours été administrés par injection directe, ce qui entrave probablement leur efficacité en raison de la clairance rapide du site d'injection. La présente étude visait à incorporer des vésicules extracellulaires de taille moyenne (mEV) dans des nanofibres à base de polyvinylpyrrolidone électrofilées à dissolution rapide pour explorer la relation structure-activité dépendante du stockage des formulations nanofibreuses résultantes. Des solutions aqueuses de précurseurs à base de polyvinylpyrrolidone ont été sélectionnées pour le procédé d'électrofilage. La présence d'EV dans les échantillons électrofilés a été confirmée par microscopie électronique à transmission, cytométrie en flux et microscope confocal à balayage laser. Les résultats indiquent que la structure fibreuse des échantillons a été préservée jusqu'à la fin de la période de stockage de 12 semaines. De plus, quelle que soit la température de stockage (4 ° C ou température ambiante), les nanofibres et les véhicules électriques associés aux nanofibres étaient présents tout au long de la période expérimentale. L'incorporation de véhicules électriques dans une base de distribution polymère solide stable pourrait préserver leur stabilité ; en attendant, selon les caractéristiques du polymère, leur libération ciblée et contrôlée peut être obtenue.

Les vésicules extracellulaires (EV) sont de petites vésicules délimitées par une bicouche lipidique qui diffèrent par leur taille et leur biogenèse, sont naturellement libérées par les corps/amphisomes multivésiculaires ou la membrane plasmique, puis pénètrent dans les fluides corporels1. En plus de leur rôle physiologique dans l'homéostasie cellulaire, la communication intercellulaire et la réponse immunitaire en tant que transporteurs biocompatibles naturels de substances bioactives, un intérêt récent s'est tourné vers leur utilisation comme moyen d'administration de médicaments2,3. Les véhicules électriques peuvent permettre l'internalisation efficace des médicaments encapsulés dans des vésicules4,5. Les véhicules électriques peuvent être absorbés par les cellules réceptrices, ce qui permet leur application à la fois en tant que thérapie primaire ou véhicule d'administration de médicaments.

Les véhicules électriques dérivés de cellules souches mésenchymateuses (MSC-EV) ont montré un potentiel prometteur dans la régénération tissulaire. Cependant, leur potentiel thérapeutique est limité par leur déplétion rapide et leur courte demi-vie6. Diverses approches d'incorporation exogène de médicaments dans des véhicules électriques isolés ont été décrites, allant de la simple incubation, des molécules lipophiles ou des techniques de chargement actif de composés hydrophobes, telles que la congélation-décongélation et la perméabilisation répétées avec de la saponine, l'extrusion, l'ultrasonication et l'électroporation7. Les molécules encapsulées dans les véhicules électriques peuvent être des substances biologiques fonctionnellement actives, notamment des protéines, des ARNm et des miARN, capables de transmettre des signaux aux cellules cibles environnantes ainsi qu'aux organes distants via les vaisseaux sanguins et lymphatiques8. La complexité structurelle des produits biologiques peut également poser des problèmes supplémentaires de formulation et de livraison, en particulier en ce qui concerne la stabilité. Pour atteindre le tissu cible, l'EV peut être administré par différentes voies, telles que la voie intraveineuse, intrapéritonéale, orale, intranasale et sous-cutanée. Cependant, les VE ont presque toujours été administrés sous forme d'injections directes, ce qui est susceptible d'inhiber leur efficacité en raison de l'efflux rapide du site d'injection9. Pour minimiser l'action toxique des véhicules électriques dans les organes non cibles et maximiser les effets thérapeutiques escomptés, les véhicules électriques isolés doivent être incorporés dans des biomatériaux capables de contrôler leur libération.

Les véhicules électriques peuvent être séparés du milieu conditionné des cultures cellulaires. Concernant le stockage du milieu conditionné, la Société internationale des vésicules extracellulaires recommande (MISEV2018) le stockage des VE dans une solution saline tamponnée au phosphate à -80 °C dans des récipients siliconés pour empêcher l'adhérence des VE aux surfaces10 à - 80 °C.

Récemment, du PBS contenant de l'HEPES, de l'albumine sérique humaine et du tréhalose11. Cependant, l'utilisation de cette condition de stockage peut être limitée par des problèmes de coût et de transport.

Ainsi, des solutions alternatives sont nécessaires pour améliorer la stabilité de stockage des véhicules électriques12. Sur la base de certaines études antérieures13,14, on peut conclure que l'incorporation de véhicules électriques dans des nanofibres pourrait être une bonne solution pour surmonter leurs problèmes de stabilité. Il a été démontré que les cellules restent viables après l'électrofilage, et les fibres remplies de cellules résultantes peuvent être utilisées pour une variété d'applications thérapeutiques. Trindade et al.15 ont développé des échafaudages à dissolution rapide pour permettre une évaluation rapide de la charge EV. Ils ont constaté que le choix du solvant est particulièrement pertinent lors du traitement de matériel biologique dans l'électrofilature à fluide unique. Le trifluoroéthanol a été utilisé à la place de l'éthanol car il s'agit d'un solvant plus doux sur les échantillons biologiques16. L'électrofilage est une technologie rapide, rentable, évolutive et à température ambiante qui peut former des structures nanofibreuses complexes et un bon choix pour la formulation d'actifs sensibles.

Dans notre projet, la polyvinylpyrrolidone (PVP) a été choisie comme base de la formulation nanofibreuse électrofilée. Le PVP est un polymère inerte, non toxique et biocompatible, ce qui en fait un excipient polyvalent pour les formulations conventionnelles et les nouveaux systèmes d'administration contrôlés ou ciblés, servant de liant, d'agent d'enrobage, d'agent de suspension, de porogène, de solubilisant, de stabilisant, etc. Le PVP avec différents poids moléculaires et concentrations est utilisé dans une variété de formulations à des fins différentes. En raison de la solubilité dans l'eau, de l'hydrophilie et de la capacité de formation de liaisons hydrogène peuvent améliorer la biodisponibilité et la stabilité des ingrédients pharmaceutiques actifs, peuvent améliorer la stabilité physicochimique des préparations, peuvent ajuster le taux de libération des médicaments et peuvent prolonger l'in vivo temps de circulation des liposomes17,18.

Les échantillons nanofibreux contenant des mEV peuvent être dissous ex tempore, ainsi la bonne propriété soluble dans l'eau de la matrice est essentielle. De plus, le PVP est un bon choix pour le processus de formation de fibres car il possède également une excellente propriété électrofilable19,20,21,22. Une solution isotonique est nécessaire pour préserver la structure des véhicules électriques, mais la tension superficielle de la solution augmente, ce qui rend plus difficile le processus de formation de fibres stables. Il existe d'autres polymères hydrophiles et biocompatibles, par exemple les dérivés de cellulose, qui sont également couramment utilisés dans les formulations pharmaceutiques, mais la formation de fibres à partir de leurs solutions aqueuses est difficile, sans parler de leurs solutions isotoniques23,24,25. Or, les nanofibres de cellulose forment naturellement des réseaux nanoporeux ; par conséquent, il peut potentiellement piéger des véhicules électriques nanométriques proches de la taille des pores des nanofibres de cellulose. De plus, différentes interactions chimiques telles que via la liaison hydrogène, les forces électrostatiques ou d'autres interactions spécifiques pourraient améliorer l'efficacité de l'isolation26.

La meilleure compréhension de la meilleure façon de stocker les véhicules électriques thérapeutiques isolés et traités permettrait aux approches basées sur les véhicules électriques d'atteindre leur plein potentiel polyvalent en tant que nouvelle classe de thérapies prometteuses et de transporteurs de médicaments. Par conséquent, le présent travail vise à étudier l'incorporation d'EV dans des nanofibres biodégradables à base de PVP électrofilées à dissolution rapide préparées à partir d'une solution aqueuse de précurseur et à explorer la relation structure-activité dépendante du stockage des formulations nanofibreuses résultantes. Notre caractérisation des formulations nanofibreuses comprenait l'évaluation de la morphologie, des propriétés physicochimiques et de la stabilité au stockage.

Comme base de la formulation, le polymère biodégradable et biocompatible bien électrofilable polyvinylpyrrolidone (PVP, Kollidon K90, poids moléculaire moyen, Mw ~ 1 500 000 g mol-1 (Merck Ltd, Budapest, Hongrie) a été choisi. Polysorbate 80 (Molar Chemicals Ltd., Budapest , Hongrie) a été utilisé pour diminuer la tension superficielle de la solution et améliorer la capacité de formation de fibres de la solution de précurseur isotonique. Le chlorure de sodium (Molar Chemicals, Budapest, Hongrie) a été utilisé pour l'isotonisation de la solution de précurseur à base de PVP utilisée pour Pour la préparation de la solution, de l'eau distillée de qualité pharmacopée sans autre purification a été utilisée.

La lignée cellulaire HEK293T-palmGFP a été aimablement fournie par Charles Lai et Xandra Breakefield. Les cellules HEK293T-palmGFP ont été cultivées dans du DMEM contenant 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS), 1 000 U/L de pénicilline, 1 000 U/L de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1 g/L de glucose. Les cellules ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % (v/v) de CO2. L'état d'infection à Mycoplasma de la culture cellulaire a été surveillé. Le milieu conditionné a été recueilli 24 h après la privation de FBS à partir de huit flacons de surface traités de 182,5 cm2 (VWR, USA). Le nombre de passages variait de 16 à 22 et la culture cellulaire atteignait 80 à 90 % de confluence, représentant 179 × 106 ± 69,3 × 106 cellules par séparation. Pendant la séparation EV, la viabilité cellulaire a été déterminée par coloration au bleu trypan et cytométrie en flux, coloration avec TO-PRO-3 et Annexin V. Pendant la séparation EV, le milieu conditionné a été centrifugé à 300 g à 4 ° C pendant 10 min et a été filtré avec un tamis cellulaire de 5 μm (Millipore, USA). Les Ev de grande taille ont été retirés à 2000 g à 4 ° C pendant 30 min. Les mEV ont été séparés du surnageant à 12 500 g à 4 ° C pendant 40 min. Le culot mEV a été lavé une fois avec du NaCl-HEPES (10 mM, 12 500 g, 4 ° C, 40 min). Le culot mEV a été remis en suspension dans 100 µL de NaCl-HEPES (10 mM). 50 µL (1,6 × 109 ± 6,7 × 108 particules) ont été utilisés pour former des nanofibres de PVP contenant des mEV (PVP-mEV), 42 µL (1,3 × 109 ± 5,6 × 108 particules) ont été utilisés pour générer des échantillons de contrôle mEV libres, et 8 µL a été utilisé pour caractériser la fraction mEV. La présence de mEV a été confirmée par microscopie électronique à transmission (TEM), cytométrie en flux, analyse de suivi des nanoparticules (NTA), quantification des protéines et des lipides. Les paramètres détaillés des étapes de centrifugation sont résumés dans le tableau S1.

La morphologie des Evs a été examinée par microscopie électronique à transmission (TEM). Les échantillons ont été préparés avec des modifications mineures sur la base des travaux de Théry et ses collègues27. En bref, 2 à 3 µL de l'échantillon ont été placés sur une grille revêtue de formvar (Sigma, USA) et incubés pendant 10 min à température ambiante (RT). La solution résiduelle a été retirée et fixée avec du glutaraldéhyde à 2 % pendant 10 min. Les grilles ont été lavées trois fois pendant 5 min puis le contraste a été augmenté avec de l'oxalate d'uranyle. Les échantillons ont ensuite été mis en contraste et inclus dans un mélange de 4 % (p/v) d'acétate d'uranyle et de 2 % (p/v) de méthylcellulose. Les échantillons ont été testés avec JEOL 1011 TEM (JEOL Ltd., Tokyo, Japon).

La distribution de taille, la taille médiane et la concentration de particules de mEV ont été déterminées à l'aide de NTA. La mesure a été effectuée avec un ZetaView PMX-120 (Particle Metrix GmbH, Meerbusch, Allemagne) en utilisant le logiciel ZetaVIEW. Les paramètres de la mesure sont résumés dans le tableau supplémentaire 2. Le NTA n'était pas adapté à la caractérisation des mEV intégrés dans les fibres PVP, car le nombre de particules détectées a augmenté de manière significative après la dissolution des fibres PVP pures (Fig. S1.).

La concentration en protéines a été déterminée à l'aide d'un test Micro BCA (ThermoFisher, USA) pour lequel des échantillons EV ont été préparés par 3 à 4 cycles de congélation-décongélation et sonication (10 min, 4 ° C). La teneur en lipides a été mesurée par le dosage des lipides sulfophosphovanilline optimisé par Visnovitz et al., 201928.

Les mEV ont été caractérisés par le cytomètre en flux CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA) basé sur la détection de GFP, AnnexinV, CD81 et CD63. Les mEV ont été dilués dans un tampon de liaison à l'annexine (AxBB, HEPES 10 mM, NaCl 0,14 M, CaCl2 2,5 mM) contenant de l'annexine V conjuguée au fluorochrome ou des anticorps. Les réactifs suivants ont été utilisés : AnnexinV-AF647 (1:200, Sony Biotechnology, USA), monoclonal anti-human CD81-PerCP-Cy5.5 (1:200, isotype : mouse IgG1, clone : 5A6, Sony Biotechnology, USA) , monoclonal anti-humain CD63-PerCP-Cy5.5 (1:200, isotype : souris IgG1, clone : H5C6, Sony Biotechnology, USA), monoclonal murin IgG1-PerCP-Cy5.5 (1:200, clone : MOPC21, Sony Biotechnology, États-Unis). Après 15 min d'incubation, les échantillons ont été analysés pendant une minute à un débit moyen (30 µL/minute). La présence de mEV a été confirmée par la lyse au Triton X-100 (0,1 %, Molar Chemicals Kft., Budapest, Hongrie). Les données brutes ont été traitées avec le logiciel FlowJo-V10. Tous les anticorps utilisés dans cette expérience sont répertoriés dans le tableau S3.

Des solutions aqueuses de précurseur de polymère PVP à 15 % (p/p) pures et chargées en mEV ont été rendues isotoniques avec du NaCl et ont été utilisées pour le processus de formation de fibres. Pour améliorer la capacité de formation de fibres de la conductivité et de la tension superficielle accrues des solutions isotoniques, du polysorbate 80 a été ajouté à 1 % (p/p).

Un dispositif d'électrofilage de taille laboratoire (SpinSplit Ltd., Budapest, Hongrie) a été utilisé pour préparer les échantillons fibreux. Des solutions homogènes de précurseur placées dans une seringue en plastique (seringue Luer lock, Merck Ltd., Budapest, Hongrie) ont été connectées à un émetteur conventionnel (22 G) avec un tube en Téflon. La pompe à seringue a fourni le débit continu de la solution de précurseur. La tension appliquée était de 22 à 23 kV, la distance émetteur-collecteur était de 20 cm et le débit était de 0, 08 μL / s pendant le processus de formation des fibres. Les expériences d'électrofilage ont été réalisées dans une pièce bien tempérée avec une température de 22 ± 1 °C et 40 ± 5 % d'humidité.

L'analyse morphologique des échantillons électrofilés a été réalisée avec un microscope électronique à balayage (MEB) de type JEOL JSM-6380LA (JEOL Ltd., Tokyo, Japon), après pulvérisation d'or. Les mesures ont été effectuées à une tension d'accélération de 15 kV et une distance d'échantillonnage de 10 mm. Des échantillons formés sur la feuille d'aluminium ont été fixés à des lingots de cuivre avec un adhésif carbone double face, puis examinés après dorure à plusieurs grossissements. Les diamètres des fibres ont été mesurés avec le logiciel ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) et le diamètre moyen des fibres a été calculé sur la base de 100 fibres individuelles différentes sélectionnées au hasard à un grossissement de 3500 ×.

La stabilité des mEV libres et des PVP-mEV conservés à 4 ° C ou à température ambiante a été surveillée deux fois par semaine pendant 12 semaines avec un cytomètre en flux. Les nanotubes de PVP-mEV ont été retirés de la surface de la feuille d'aluminium à l'aide d'une spatule et la masse dans un tube Eppendorf a été mesurée à l'aide d'une balance analytique. Les nanotubes de PVP-mEV ont été dissous dans AxBB (33,9 ± 3,7 µL AxBB/ 1 mg PVP-mEV). Des nanofibres vierges de PVP ont été utilisées comme témoins. Les échantillons de PVP, PVP-mEV et mEV libre ont été dilués au 10ème dans une solution d'anticorps ou d'AxBB contenant de l'annexineV. Annexine V-AF647 (1:200, Sony Biotechnology, USA), monoclonal anti-humain CD81-PerCP-Cy5.5 (1:200, isotype : souris IgG1, clone : 5A6, Sony Biotechnology, USA), monoclonal murin IgG1- PerCP-Cy5.5 (1:200, clone : MOPC21, Sony Biotechnology, USA) ont été utilisés. Après 15 min d'incubation, les échantillons ont été dilués au quintuple et mesurés avec un cytomètre en flux CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA) pendant une minute à un débit moyen (30 µL/minute). Les billes de comptage ont été utilisées à une dilution de 20 fois (Count Check Beads-High, 2,436 × 105 billes/mL, Sysmex, Allemagne) pour déterminer le nombre de mEV sur la base de l'équation suivante :

L'intégrité des mEVs a été vérifiée par lyse avec TritonX-100 (0,1%). Le logiciel FlowJo-V10 a été utilisé pour analyser les données brutes. Tous les anticorps utilisés dans cette expérience sont répertoriés dans le tableau S3.

La stabilité des échantillons de PVP-mEV conservés à 4 ° C ou RT a été surveillée quatre fois par semaine pendant 12 semaines à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser. Les nanotubes PVP-mEV étaient disponibles sur des lamelles de 24 × 32 mm (VWR, USA). Les lamelles ont été examinées avec un microscope confocal à balayage laser Leica TCS SP8 (Leica, Allemagne). La disposition inverse du microscope nous a permis de détecter la présence de mEVs associés aux nanotubes à haute résolution (l'huile d'immersion a été utilisée en bas et en haut). Les échantillons ont été testés dans les mêmes paramètres : objectif 63 ×, puissance laser 0,9 % (488 nm), indice de réfraction : 1,516, moyenne sur 16 lignes, résolution 3064 × 3064. Le signal de fluorescence GFP a été détecté par un détecteur hybride avec lumière visible à 300 V PMT.

Les valeurs sont indiquées sous forme de moyenne ± erreur standard. L'analyse statistique et les chiffres ont été préparés à l'aide du logiciel GraphPad Prism 7.00 (USA). L'ANOVA bidirectionnelle et les tests posthoc de Tukey ont été utilisés pour comparer les données. Une valeur de p inférieure à 0,05 a été acceptée comme statistiquement significative.

Les mEV ont été séparés du milieu conditionné des cellules HEK293T-palmGFP. La viabilité cellulaire était de 93,3 ± 0,9 % (avec coloration au bleu trypan). Sur la base des mesures de cytométrie en flux, la proportion de cellules apoptotiques (annexine V +) et de cellules nécrotiques secondaires (annexine V +, TO-PRO-3 +) était de 3, 9 ± 2, 0% et 5, 8 ± 2, 1%, respectivement (Fig. 1A). La distribution de taille des mEV a été déterminée par NTA (Fig. 1B), sur la base de laquelle leur taille médiane était de 332, 4 ± 25, 7 nm (Fig. 1C). Le nombre de particules était de 1,7 × 106 ± 2,2 × 105/105 cellules (Fig. 1D). Le rapport protéine/lipide des mEV était de 3,0 ± 2,5 (Fig. 1E). Sur la base des mesures de cytométrie en flux, les mEV étaient GFP, AnnexinV, CD81 et CD63 positifs et sensibles à la lyse du Triton X-100 (Fig. 1F).

Caractérisation des mEV libres dérivés de HEK293T-palmGFP. La viabilité des cellules a été analysée par cytométrie en flux (A). Nous avons déterminé la distribution de taille (B), la taille médiane (C) et la concentration de particules (D) des mEV par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Nous avons quantifié les vésicules en fonction de leur teneur en protéines et en lipides (E). La présence de GFP, de phosphatidyl-sérine externalisée (colorée à l'annexine V), de CD81 et de CD63 a été détectée par cytométrie en flux (F). (AB : coloration spécifique à l'antigène avec anticorps, Tx : Triton X-100, IC : contrôle d'isotype) (La figure a été préparée à l'aide de GraphPad Prism 7.00 pour Windows, GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis, http://www.graphpad. com).

La caractérisation morphologique des échantillons électrofilés a été réalisée par MEB. L'image montre que l'ajout de vésicules à la solution de précurseur n'a aucun effet négatif sur la formation de fibres (Fig. 2A), une structure clairement fibreuse de 465 nm ± 62 nm de diamètre moyen de fibre ± écart type avec une distribution apparemment normale a été obtenue (Fig. 2B). La surface des fibres est lisse, ce qui indique que les paramètres de production de solution et de fibres étaient appropriés pour la production de fibres.

Image SEM de l'échantillon électrofilé préparé à partir de solutions de précurseurs à base de PVP contenant des vésicules extracellulaires de taille moyenne (mEV) (grossissement : 2 500 ×) (A) et la distribution du diamètre des fibres de l'échantillon (B).

Les échantillons libres de mEV et de PVP-mEV ont été caractérisés par cytométrie en flux, microscopie confocale à balayage laser et TEM (Fig. 3A – C). Par rapport aux mEV libres, l'intensité de fluorescence médiane GFP (MFI) des PVP-mEV a diminué et l'écart type de la distribution de taille basée sur la valeur Violet-SSC a augmenté. Alors que les mEV libres étaient sensibles à la lyse du Triton X-100, le nombre de PVP-mEV n'a pas changé de manière significative. En ce qui concerne le marqueur CD81 EV, les mEV libres ont montré une valeur MFI plus élevée que les PVP-mEV. Les mEV libres ont montré une positivité à l'annexineV. En revanche, les PVP-mEV étaient négatifs à l'annexine V (Fig. 3A).

Comparaison des mEV libres et des fibres PVP chargées en mEV (PVP-mEV). Les mEV libres et les PVP-mEV ont été comparés par cytométrie en flux basée sur le signal GFP, la lyse TritonX-100, les marqueurs CD81 et phosphatidylsérine (AnnexinV) (A). Les mEV ont été détectés sur la base de la fluorescence GFP, tandis que les nanofibres ont été détectées à la lumière visible à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (B). La présence et la morphologie des mEV ont été confirmées par microscopie électronique à transmission (TEM) (C). (AB : coloration spécifique de l'antigène avec un anticorps, Tx : Triton X-100).

La présence de mEV a été détectée par microscopie confocale à balayage laser. Dans les deux échantillons, leur présence a été détectée avec succès sur la base du signal de fluorescence de la GFP. Dans le cas d'échantillons de PVP-mEV, on peut voir que les mEV sont présents sous une forme associée aux nanofibres (Fig. 3B). La morphologie des mEV libres et des PVP-mEV après la dissolution a été caractérisée par TEM. Nous avons pu identifier les mEV dans les deux échantillons (Fig. 3C).

La différence observée entre les échantillons de mEV libre et de PVP-mEV peut s'expliquer par le fait que la PVP peut se fixer à la surface des nanoparticules à base de lipides via des liaisons hydrogène29. Il forme une coque protectrice macromoléculaire qui assure la stabilité des nanoparticules et peut protéger contre l'agrégation30. Le PVP peut réduire la liaison des protéines aux liposomes en raison de sa neutralité électrique31. Étant donné que les liposomes et les EV se comportent de manière similaire à bien des égards, nous supposons qu'une enveloppe PVP peut être formée autour des mEV. En raison de la présence de la coque PVP, elle peut diminuer l'accessibilité du CD81 et de la phosphatidylsérine aux anticorps et à l'annexine V. Comme le PVP augmente la stabilité des mEV, ils ont une sensibilité plus faible à la lyse du TritonX-100.

La stabilité des PVP-mEV et des mEV libres maintenus à 4 °C ou RT a été surveillée pendant 12 semaines. Les échantillons ont été analysés toutes les deux semaines par cytomètre en flux sur la base des paramètres GFP, Violet-SSC, CD81 et du nombre de particules. Les valeurs médianes GFP MFI et Violet-SSC des mEV libres ont été augmentées (Fig. 4A, B). En parallèle, le MFI relatif de CD81 a diminué de manière significative dès la semaine 2. Cette tendance était plus prononcée pour les échantillons conservés à température ambiante (Fig. 4C). Quelle que soit la température, le nombre calculé de particules a diminué après 2 semaines et est resté faible tout au long de l'expérience (Fig. 4D). Les mEV liés aux nanofibres PVP sont restés stables pendant 12 semaines sur la base de la valeur médiane de Violet-SSC, GFP MFI et du nombre de particules (Fig. 4A, B, D). Le MFI relatif de CD81 des échantillons conservés à température ambiante a diminué de manière significative après 6 semaines, tandis que les échantillons à 4 ° C sont restés stables (Fig. 4C). La valeur MFI relative des témoins isotypes CD81 est restée faible pendant la durée de l'expérience (Fig. S2). En plus des valeurs médianes, nous avons également déterminé la valeur robuste du coefficient de variation (rCV) des courbes de distribution (Fig. S3). En ce qui concerne les mEV libres, nous avons constaté une légère augmentation des trois paramètres. Dans le cas des PVP-mEV, nous avons observé une tendance à la hausse pour le marqueur CD81 dans les échantillons RT. Sur la base de l'interaction de liaison H similaire décrite dans le PVP et la surface du liposome, les fibres de PVP peuvent former une coque protectrice macromoléculaire qui assure la stabilité des nanoparticules et peut protéger contre l'agrégation (Fig. 4E). De plus, le PVP peut réduire la liaison des protéines aux liposomes en raison de sa neutralité électrique. Étant donné que les liposomes et les véhicules électriques se comportent de manière similaire à bien des égards, nous supposons qu'une coque PVP peut être formée autour de véhicules électriques de taille moyenne. En raison de la présence de la coque PVP, elle peut diminuer l'accessibilité du CD81 et de la phosphatidylsérine aux anticorps et à l'annexine V. Comme le PVP augmente la stabilité des véhicules électriques de taille moyenne, ils ont une sensibilité plus faible à la lyse du TritonX-100.

Étude de la stabilité des fibres de PVP mEV libres et chargées de mEV (PVP-mEV) par cytométrie en flux. La stabilité des mEV libres et des PVP-mEV conservés à 4 ° C ou à température ambiante a été surveillée pendant 12 semaines, toutes les deux semaines par cytométrie en flux. La stabilité a été étudiée sur la base du signal GFP lié à la membrane des mEV (A), du paramètre Violet-SSC en corrélation avec la taille de la vésicule (B), l'expression de CD81 (C) et le nombre de particules (D). Des illustrations schématiques du mécanisme hypothétique des changements observés pour les échantillons mEV et PVP-mEV libres conservés à 4 ° C sont résumées dans le panneau (E). nmEV-GFP = 3, nViolet-SSC = 3, nCD81 = 3, nnombre de particules = 2 (La figure a été préparée à l'aide de GraphPad Prism 7.00 pour Windows, GraphPad Software, San Diego, Californie USA, http://www.graphpad.com) .

La stabilité des échantillons fibreux PVP-mEV conservés à 4 ° C ou RT a été surveillée toutes les quatre semaines pendant 12 semaines à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (semaines 0, 4, 8 et 12). Les nanofibres de PVP ont été détectées à la lumière visible, tandis que les véhicules électriques ont été détectés par leur fluorescence GFP. On peut clairement voir sur la figure 5 que la structure fibreuse de l'échantillon est restée visible jusqu'à la fin de la période de stockage de 12 semaines, de plus, quelle que soit la température (4 ° C ou RT), les nanofibres et la GFP-associée aux nanofibres des mEV positifs étaient présents tout au long de l'expérience.

Étude de la stabilité des fibres PVP chargées en mEV (PVP-mEV) par microscope confocal à balayage laser. La stabilité des PVP-mEV conservés à 4 ° C ou RT a été surveillée pendant 12 semaines, toutes les quatre semaines au microscope confocal à balayage laser.

La condition de stockage la plus prometteuse pour les véhicules électriques est de − 80 °C ; cependant, cette condition peut être limitée par des problèmes de coût et de transport. Une technique alternative de préservation des VE est la lyophilisation, mais elle est coûteuse et sa reproductibilité soulève des questions. L'électrofilature offre une bonne solution alternative pour améliorer la stabilité au stockage des vésicules. Cette technologie rapide, rentable, évolutive et à température ambiante peut former des structures nanofibreuses complexes et créer une plate-forme technologique, ce qui en fait un outil viable pour la formulation de médicaments sensibles. L'intégration des véhicules électriques dans les nanofibres permet un stockage des vésicules en phase solide préservant la stabilité, ouvrant de nouveaux horizons dans la recherche d'applications thérapeutiques.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié [et ses fichiers d'informations supplémentaires].

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Cette recherche a été soutenue par le Semmelweis Science and Innovation Fund (STIA-KF-2021) et le National Cardiovascular Laboratory Project, Hongrie. Le projet a également reçu un financement du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'UE dans le cadre de la convention de subvention n° 739593.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Krisztina Németh et Adrienn Kazsoki.

Département de génétique cellulaire et d'immunobiologie, Université Semmelweis, Nagyvárad Square 4, Budapest, 1089, Hongrie

Krisztina Németh, Tamás Visnovitz & Edit I. Buzás

Groupe de recherche translationnelle sur les vésicules extracellulaires ELKH-SE, Budapest, Hongrie

Krisztina Németh & Edit I. Buzás

Pharmacie universitaire Département d'administration de la pharmacie, Université Semmelweis, rue Hőgyes Endre 7-9, Budapest, 1092, Hongrie

Adrienn Kazsoki & Romána Zelkó

Département de physiologie végétale et de biologie végétale moléculaire, Université Eötvös Loránd, Pázmány Péter Sétány 1/C, Budapest, 1117, Hongrie

Tamás Visnovitz

Département de génie des polymères, Faculté de génie mécanique, Université de technologie et d'économie de Budapest, Műegyetem Rkp. 3, Budapest, 1111, Hongrie

Balázs Pinke & László Mészáros

Groupe de recherche ELKH-BME pour la science et la technologie composites, Université de technologie Rkp. 3, Budapest, 1111, Hongrie

László Mészáros

HCEMM-SU Groupe de recherche sur les vésicules extracellulaires, Budapest, Hongrie

Edith I. Buzas

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RZ et EIB—Conceptualisation, KN, AK, TV et BP—méthodologie, KN, AK et LM- analyse formelle, enquête—KN et AK, rédaction, préparation du projet original—KN et AK ; rédaction—révision et édition—EIB, RZ et LM, visualisation—AK et KN ; supervision—RZ, BEI

Correspondance à Edit I. Buzás ou Romána Zelkó.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Németh, K., Kazsoki, A., Visnovitz, T. et al. La formation de nanofibres comme technologie prometteuse pour la conservation et le stockage facile des vésicules extracellulaires. Sci Rep 12, 22012 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25916-6

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Reçu : 27 septembre 2022

Accepté : 07 décembre 2022

Publié: 20 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-25916-6

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