Un ensemble de vecteurs et de souches pour l'intégration chromosomique dans la levure de fission

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9295 (2023) Citer cet article

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L'expression de gènes hétérologues est une technique importante en génétique des levures. Dans la levure de fission, les gènes leu1 et ura4 ont été utilisés principalement comme marqueurs sélectionnables pour l'expression hétérologue. Pour élargir le répertoire de marqueurs de sélection disponibles pour l'expression hétérologue de gènes, nous avons développé ici de nouveaux systèmes hôte-vecteur employant lys1 et arg3. En utilisant l'édition du génome avec le système CRISPR/Cas9, nous avons isolé plusieurs allèles de lys1 et arg3, chacun ayant une mutation critique dans la région ORF. En parallèle, nous avons développé un ensemble de vecteurs qui complètent l'auxotrophie en acides aminés des mutants lys1 et arg3 lorsqu'ils sont intégrés dans chaque locus. En utilisant ces vecteurs en combinaison avec le vecteur d'intégration pDUAL précédemment développé, nous avons observé avec succès la localisation de trois protéines dans une cellule simultanément en les fusionnant avec différentes protéines fluorescentes. Ainsi, ces vecteurs permettent l'expression combinatoire de gènes hétérologues, ce qui répond à des défis expérimentaux de plus en plus diversifiés.

L'étude de la biologie de la levure a stimulé le développement de systèmes expérimentaux sophistiqués pour élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à une variété de phénomènes biologiques. Récemment, pour explorer plus profondément ces mécanismes moléculaires, des systèmes expérimentaux compliqués sont parfois nécessaires. Dans de nombreux cas, une expérience aussi compliquée nécessite l'expression de plusieurs transgènes dans une cellule. A cet effet, plusieurs vecteurs, utilisables comme plasmides épisomiques ou vecteurs intégratifs, et promoteurs constitutifs ou inductibles ont été développés1, 2. Les systèmes d'expression capables de reproduire des conditions proches des environnements physiologiques sont privilégiés. En ce sens, l'utilisation de vecteurs intégratifs est l'un des systèmes de pointe utilisés en biologie de la levure plutôt que les vecteurs épisomiques3.

Nous avons précédemment développé deux types de vecteurs épisomiques qui peuvent également être utilisés pour l'intégration chromosomique par recombinaison croisée simple4, 5. Un type de vecteur est conçu pour être intégré dans les locus lys1, arg1 ou his3. Lorsque ces vecteurs sont intégrés avec succès dans les locus cibles, les transformants deviennent auxotrophes pour les acides aminés correspondants. L'intérêt de ces vecteurs est qu'ils peuvent être utilisés pour des souches dépourvues d'auxotrophie en acides aminés. Par conséquent, dans de nombreux cas, ces vecteurs peuvent être utilisés sans préparer une nouvelle souche hôte. Cependant, le fait que l'intégration des vecteurs dans le génome entraîne une auxotrophie des acides aminés est un inconvénient dans certains cas. D'autre part, les vecteurs de la série pDUAL sont conçus pour être intégrés dans le locus leu14. Bien qu'ils ne puissent être utilisés que pour des souches ayant l'allèle leu1-32, les transformants deviennent prototrophes pour la leucine, permettant une sélection aisée des transformants (Fig. 1). Le fait que les vecteurs pDUAL ne contiennent pas de copie fonctionnelle du gène leu1 évite la sélection de transformants dans lesquels les plasmides sont intégrés de manière aléatoire dans le génome. Bien que les deux types de vecteurs aient leurs propres avantages et inconvénients, les vecteurs de type pDUAL semblent plus utiles du point de vue de la sélection et du maintien des transformants appropriés.

Intégration de pDUAL dans le génome du mutant leu1-32. Les vecteurs de la série pDUAL ont une partie du gène leu1 contenant des sites de reconnaissance d'enzymes de restriction dans la région ORF leu1. Lorsqu'une recombinaison croisée unique se produit en aval du point de mutation de l'allèle leu1-32, le génome résultant devrait avoir deux copies de leu1, l'une dépourvue de la partie 3 'et l'autre étant un gène fonctionnel de pleine longueur. Le schéma n'est pas à l'échelle.

Dans cet article, en prenant en compte la stratégie de recombinaison croisée simple de type pDUAL, nous avons essayé de développer de nouveaux systèmes hôte-vecteur ciblant des loci autres que leu1. En utilisant le système CRISPR/Cas9 récemment développé dans la levure de fission6, nous avons réussi à isoler des souches présentant des mutations de décalage de cadre critiques dans lys1 ou arg37, 8. Nous avons également construit des vecteurs qui pourraient compléter l'auxotrophie des acides aminés de ces mutants lors d'une intégration ciblée dans le chromosome. Avec les vecteurs pDUAL précédemment développés, l'expression de trois transgènes dans des transformants prototrophes est désormais disponible sans utiliser de marqueurs résistants aux médicaments.

Les souches de S. pombe utilisées dans cette étude étaient dérivées des souches de type sauvage JY743 (h– leu1-32 ura4-D18) ou AM324 (h+ leu1-32). L'ADN génomique de JY3 de type sauvage (prototrophe h90) a été utilisé pour l'amplification par PCR de fragments de gène pour la construction de plasmide. Le milieu complet YE (0,5 % d'extrait de levure, 2 % de glucose, 5 ug/ml d'adénine) et les milieux minimaux SD et EMM29 ont été utilisés pour la culture des transformants. La leucine, l'arginine, la lysine, l'histidine et l'uracile ont été utilisés à une concentration finale de 50 ug/ml chacun, si nécessaire. EMM2 a également été utilisé pour l'induction transcriptionnelle d'ORF fusionnés avec des protéines fluorescentes sous la régulation du promoteur nmt110.

Des méthodes génétiques pour manipuler la levure de fission ont été décrites précédemment9. La transformation des cellules de S. pombe a également été décrite11. Les transformants Ura+, Lys+ et Arg+ ont été sélectionnés sur un milieu SD dépourvu d'uracile, de lysine et d'arginine, respectivement. Lors de l'isolement des allèles mutants de lys1, arg1 et his1, les transformants ont été cultivés sur un milieu SD contenant de la leucine et de la lysine, de l'arginine ou de l'histidine, respectivement.

L'isolement des souches présentant des mutations critiques dans les gènes impliqués dans les voies de biosynthèse des acides aminés a été réalisé à l'aide du système CRISPR/Cas9 tel que rapporté par Zhang et al.12, avec de légères modifications. Les plasmides pDB4280 (n° de catalogue 98699) et pDB4282 (n° de catalogue 98701) pour le système de levure de fission CRISPR/Cas9 ont été fournis par le référentiel Addgene. La conception d'ARN à guidage unique (ARNsg) a été réalisée à l'aide de l'outil Web CRISPR4P13. Parmi les sites cibles suggérés par ce programme, nous avons sélectionné deux séquences pour chaque gène, qui sont positionnées relativement près de l'extrémité 5' de chaque ORF. Les bras d'homologie ont été raccourcis à 30 nt par rapport aux 40 nt indiqués par Zhang et al.12. Les séquences d'annelage avec le vecteur matrice pDB4282 ont été raccourcies à 20 nt, par rapport aux 23 nt indiqués par Zhang et al. Les séquences d'amorces utilisées étaient les suivantes : his1-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAACAAGTCCAGGTACCTGAGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), his1-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAAGGTGAGACAATGCGTGCATCGTTTAGAGCTAGAAATAGC), arg3-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATCATGATCTCTCC GGTGACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), arg3-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATCCATTCGTGATCTTAGTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC), lys1-sgRNA1 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAGAATTTAGCCAAAGTGTGCGATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC) et lys1-sgRNA2 (TTGCCAAAAAACATAACCTGTACCGAAG AAATCCTCGTTAGTCGCATGACGTTTTAGCTAGAAATAGC). Chaque amorce a été utilisée en PCR en combinaison avec l'amorce ura4-P75 (CATCTGGTGTGTACAAAATTG) pour amplifier la région de pDB4282 contenant une partie du marqueur ura4, la séquence ribozyme en tête de marteau et la séquence d'échafaudage sgRNA12. La réaction de PCR a été effectuée à une échelle de 20 µl et le succès de l'amplification a été confirmé par électrophorèse sur gel d'agarose. Le produit de PCR (2,5 ul) a été directement utilisé pour la transformation de la souche hôte JY743 avec le plasmide pDB4280 digéré avec Notl et purifié par précipitation à l'éthanol. Un microgramme d'ADN de sperme de saumon a également été utilisé pour la transformation. Les transformants ont été cultivés sur une plaque SD contenant de la leucine et de l'histidine, de l'arginine ou une plaque pour préparer des plaques maîtresses. L'auxotrophie des acides aminés des transformants a ensuite été confirmée en les striant sur la plaque SD dépourvue d'un acide aminé correspondant.

Tous les mutants lys1 et arg3 utilisés dans cette étude ont été déposés au Yeast Genetic Resource Center (YGRC/NBRP) du Japon, aux côtés de souches obtenues à partir de mutants lys1-K24 ou arg3-R25 via des croisements génétiques avec des mutants ade6 et ura4. Les souches ont reçu les ID d'accession FY47712-FY47734.

L'analyse de la séquence des allèles auxotrophes de la lysine a été effectuée comme décrit ci-dessous. La région autour du site cible du sgRNA a été amplifiée par PCR en utilisant le génome de chaque candidat. Les amorces utilisées pour l'amplification de la région autour des sites cibles de lys1-sgRNA#1 et lys1-sgRNA#2 étaient lys1-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCTTGACACTCTCCGTTAC) et lys1-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCCACCGATAGGACCTGTAA). Les fragments de PCR résultants ont été clonés dans le vecteur pUC119 par la technique de clonage gap-repair14. Les inserts entiers ont été séquencés en utilisant un analyseur d'ADN 3730xl (Applied Biosystems).

Une analyse de séquence a également été effectuée pour les allèles mutants de his1 et arg3 d'une manière similaire. Les amorces utilisées étaient les suivantes : arg3-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCGCAGTCTGAGAGAGAACTAG) et arg3-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCGTCTTTAGAAGCCTGTGTC) pour arg3 ; et his1-F-puc119 (CTCTAGAGGATCCCCTGCATAGAGGGTCGTTT) et his1-R-puc119 (TCGAGCTCGGTACCCCGAGTGAATGCTGAGGA) pour his1. Les produits de PCR ont été clonés dans le vecteur pUC119 de E. coli digéré avec Smal.

Pour construire le vecteur pCLys1, nous avons remplacé le fragment leu1 de pDUAL contenant le promoteur nmt14 par une partie du gène lys1 contenant le promoteur lys1 et la partie 5' de son ORF. Cette région a été amplifiée par PCR en utilisant l'ADN génomique de la souche JY3 de S. pombe de type sauvage. Le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction pour NotI a été généré dans cette région en caténant deux fragments de PCR contenant le site NotI d'un côté par PCR. Les amorces utilisées étaient les suivantes : KpnI-Plys1-F3 (GGGATAACAGGGTAATATGGTACCGAGCTGTTTGGACATGTTATG) et NotI-lys1-R3 (AACTACATCAGCGGCCGCTCTCAATTCCATTCTTTACGAG) ; et NotI-lys1-F4 (GGAATTGAGAGCGGCCGCCTGATGTAGTTATGGTTTATGC) et EcoRI-lys1-R4 (CGTTGTAAAAACGACGGCCAGTGAATTCGTCAGCTCCTTTTGAGACTG). Le clonage du fragment PCR caténé dans le vecteur a été réalisé à l'aide du kit In-Fusion HD (TaKaRa Bio).

La construction du vecteur pCArg3 a été réalisée de manière similaire. Les amorces utilisées étaient les suivantes : KpnI-Parg3-F1 (GGGATAACAGGGTAATATACTAGTCGGTACCTGAGTTATCAATATAGTAACAC), NotI-arg3-R1 (AACGTTATTGCGGCCGCATCACCTACCCATGCAAC), NotI-arg3-F2 (GTAGGTGATGCGGCCGCAATAACGTTTTACATGATTTG) et EcoRI-arg3-R 2 (TGTAAAACGACGGCCAGTGA ATTCAGCATTTTTAACAGCAACC).

Les séquences complètes de pCLys1 et pCArg3 sont déposées dans la base de données DDBJ avec les numéros d'accession LC745737 et LC745738, respectivement. Ces plasmides ont également été déposés au Yeast Genetic Resource Center du Japon avec les numéros d'accession pour FYP5995 (pCLys1) et FYP5996 (pCArg3), de sorte qu'ils sont disponibles sur demande.

La construction des vecteurs pCLys1 et pCArg3 contenant GFP ou mCherry a été achevée comme décrit ci-dessous. Tout d'abord, l'ORF de GFP ou de mCherry a été cloné dans chacun de pCLys1 et pCArg3. Les amorces utilisées pour l'amplification de la GFP étaient les suivantes : Nhel-GFP-F (TTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCCTCGAGCCCGGGATGAGTAAAGGAGAAGAAC) et BamHI-GFP-R (GCTTATTTAGAAGTGGCGCGCCGGATCCCGGGTTTGTATAGTTCATCCATGCC). pDUAL-GFH14 a été utilisé comme matrice pour la PCR. Un fragment GFP a été amplifié puis mélangé avec pCLys1 ou pCArg3 digéré par Nhel et BamHI, et le mélange a été introduit dans des cellules compétentes de la souche E. coli DH5α. mCherry a également été cloné dans les mêmes vecteurs de manière similaire. Les amorces utilisées pour l'amplification de mCherry étaient SmaI-mC-F (TTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCCTCGAGATGTGTGAGCAAGGG) et SmaI-mC-R (ATTTAGAAGTGGCGCGCCGGATCCCGAGCTCGTCCATGCCGCCG). Le fragment mCherry amplifié a été mélangé avec les vecteurs digérés avec SmaI, suivi d'une introduction dans E. coli.

Les ORF à fusionner avec GFP ou mCherry ont été amplifiés par PCR à partir de notre collection de clones d'entrée de la levure de fission ORFeome15. Les amorces utilisées pour l'amplification étaient Ent-GFP-R (CCTTTACTCATCCCGGGCTCGAGGCTAGCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTA) pour la fusion GFP et Ent-mC-R2 (CGCCCTTGCTCACCATCTCGAGGCTAGCAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTG) pour la fusion mCherry, en combinaison avec 221_pREY_F (ACTTATAGTCGCTTTGTTAAAGCTAGCGATATCAAAAAAGC AGGCTCTCATATG) en tant que partenaire des deux amorces ci-dessus. Chaque ORF amplifié a été cloné dans pCLys1 ou pCArg3 contenant GFP ou mCherry via des techniques de réparation des lacunes. Le clonage d'un ORF dans le vecteur pDUAL ayant YFP (pDUAL-YFH1c) a été réalisé par la technologie Gateway.

La fluorescence de CFP, GFP, YFP et mCherry a été observée à l'aide du microscope à fluorescence tout-en-un BZ-X700 (KEYENCE). L'objectif CFI Plan Apo λ 100XH (Nikon) a été utilisé. Les cellules ont été précultivées sur une plaque YE ou EMM2 contenant de la thiamine, puis striées sur une plaque EMM2 pour induire l'expression de protéines fluorescentes fusionnées aux protéines pilotées par le promoteur nmt1.

Pour permettre une intégration chromosomique à croisement simple de type pDUAL, des souches ayant une mutation ponctuelle dans des gènes codant de préférence pour des protéines fonctionnant dans la voie de biosynthèse des acides aminés ou des nucléotides sont nécessaires. Il existe plusieurs mutants auxotrophes de ce type dans la levure de fission. Cependant, les points de mutation de la plupart d'entre eux n'ont pas été identifiés ou ne conviennent pas à une complémentation médiée par l'intégration compte tenu de la position. Nous avons donc utilisé le système CRISPR/Cas9 pour isoler de tels mutants de la voie de biosynthèse, selon la méthode sans clonage récemment rapportée par Zhang et al.12.

Dans le domaine de la génétique des levures à fission, leu1, ade6 et ura4 ont été largement utilisés comme marqueurs de sélection16,17,18. Le gène leu1 est situé sur le bras droit du chromosome 2, tandis que ade6 et ura4 sont situés sur le chromosome 3. Nous avons sélectionné des loci d'intégration du chromosome 1 pour permettre une manipulation aisée dans le croisement génétique entre les nouveaux marqueurs et les trois loci ci-dessus. En conséquence, nous avons sélectionné trois gènes - lys1, arg3 et his119 - comme locus cibles. Nous avons ensuite conçu des séquences d'ARN à guidage unique ciblant le cadre de lecture ouvert de ces gènes, à l'aide du programme de prédiction de sgRNA basé sur le Web CRISPR4P13. Parmi les séquences cibles de sgRNA suggérées par CRISPR4P, nous avons sélectionné deux séquences qui se trouvent à proximité du codon d'initiation de chaque ORF, car un allèle dans lequel une mutation ponctuelle est située près de l'extrémité 5' ou 3' d'un ORF est adapté à l'intégration chromosomique à croisement unique.

Nous avons introduit des fragments de PCR comprenant des séquences cibles d'ARNsg et une partie de ura4+ dans un mutant ura4-D18 JY743 avec pDB4280 digéré contenant Cas9 et la partie 5' de ura4+12. Après détection des transformants Ura+, nous avons vérifié l'auxotrophie des acides aminés des transformants. Semblable à la situation observée pour his1, de nombreux transformants Ura + ont été obtenus à la fois à partir de la transformation sgRNA # 1 et # 2. Cependant, seules quelques souches ont montré une auxotrophie des acides aminés, ce qui suggère que ces ARNsg n'étaient pas efficaces pour cibler chaque site. Il en était de même pour les transformants lys1 sgRNA #1. Au contraire, dans le cas des transformants lys1 sgRNA #2, de nombreux transformants ont montré une auxotrophie des acides aminés, malgré le nombre inférieur de transformants par rapport au lys1 sgRNA #1. De nombreux transformants auxotrophes ont également été obtenus à partir de deux ARNsg différents dans le cas d'arg3. Nous avons ensuite analysé si et où une mutation s'est produite dans le gène ciblé par séquençage après amplification par PCR de la région ORF. En conséquence, nous avons trouvé plusieurs mutations dans lys1 et arg3, mais pas dans his1 (Fig. 2a, b). Il y avait également plusieurs mutants auxotrophes de l'arginine qui n'avaient pas de mutations dans la région ORF de arg3, similaire à la situation de his1. Cela peut être dû à des effets hors cible, comme cela est souvent discuté avec le système CRISPR/Cas9. La plupart des mutations trouvées étaient des délétions ou des insertions d'un seul nucléotide, qui ne se produisaient que dans la séquence utilisée comme cible d'ARNsg.

Mutations de mutants auxotrophes isolés dans cette étude. Toutes les mutations des mutants (a) lysine et (b) arginine-auxotrophes ont été trouvées dans les régions ciblées par les sgARN. Les séquences nucléotidiques autour des séquences cibles de l'ARNsg sont présentées et les séquences d'acides aminés sont présentées ci-dessous dans le contexte du cadre de lecture. Le numéro du premier nucléotide de chaque ORF est fixé à 1. Les séquences ciblées de sgRNA sont soulignées. Un nucléotide inséré est indiqué en minuscules. Un trait d'union indique un nucléotide supprimé. Un astérisque indique un codon de terminaison. Les changements d'acides aminés dans la séquence par défaut sont indiqués en italique. ( c ) Les séquences de nucléotides et d'acides aminés de l'allèle arg3-R25. La séquence nucléotidique insérée est indiquée en gras. La séquence d'acides aminés attendue de la protéine exprimée à partir de l'allèle arg3-R25 est présentée sous la séquence de nucléotides.

Parmi ces mutants, l'allèle arg3-R25 contient un insert de 262 nucléotides (Fig. 2c). Conformément à ce résultat, un produit plus long a été obtenu par amplification PCR de ce locus lorsque le génome de la souche arg3-R25 a été utilisé comme matrice. Une recherche BLASTN de cette séquence a révélé une correspondance complète avec une partie du génome d'Oncorhynchus tshawytscha, connue sous le nom de saumon quinnat ou saumon royal. Ce résultat suggère fortement que la séquence de 262 pb provenait de l'ADN de sperme de saumon utilisé dans la transformation des cellules de levure, comme indiqué précédemment20. Bien que l'ADN de sperme de saumon que nous avons utilisé provienne de l'espèce de saumon Oncorhynchus keta, nous n'avons trouvé aucune séquence correspondant à la séquence de 262 pb dans l'ensemble de données O. keta disponible. Par conséquent, nous avons enregistré cette séquence dans la base de données DDBJ comme faisant partie du génome d'O. keta (n° d'accès LC764838). Parce que l'insertion d'un long fragment était avantageuse pour l'intégration chromosomique d'un plasmide afin d'éviter la complémentation basée sur la conversion génique d'une mutation21, nous avons sélectionné l'allèle arg3-R25 qui sert de cible pour le vecteur d'intégration. Dans le cas de lys1, nous avons sélectionné l'allèle lys1-K24, présentant une délétion de l'adénine au 268ème nucléotide du début de l'ORF lys1, entraînant la génération d'un codon de terminaison juste en aval de ce site de mutation (Fig. 2a) .

Parallèlement à l'isolement des mutants, nous avons conçu et construit des vecteurs d'intégration chromosomique. Pour la construction d'un vecteur nommé pCLys1 (Fig. 3a) pouvant être intégré au locus lys1, nous avons amplifié la région génomique contenant le promoteur et la partie 5 'de l'ORF lys1 et remplacé la région leu1 du vecteur pDUAL par eux. Le fragment lys1 cloné devait être non fonctionnel, car seulement moins de 30 % de l'ORF lys1 était cloné. Ce court fragment lys1 a d'abord été amplifié par PCR à partir du génome de type sauvage en deux parties, puis fusionné avec un site de reconnaissance NotI entre eux. Ainsi, le gène partiel cloné a pu être scindé en deux dans la région ORF par digestion Notl. Le site NotI a été créé à environ 700 pb en aval du point de mutation de l'allèle lys1-K24. Si le vecteur pCLys1 linéarisé par digestion NotI est intégré dans le locus lys1 ayant la mutation lys1-K24, un gène lys1 fonctionnel serait généré et les transformants devraient être prototrophes pour la lysine (figure 4a).

Vecteurs développés dans cette étude. Structure de pCLys1 (a) et pCArg3 (b). Le marqueur de sélection est constitué du promoteur et d'une partie de l'ORF de lys1 (pCLys1) ou arg3 (pCArg3). Les deux vecteurs ont le promoteur nmt1 et le terminateur ADH1 pour l'expression du gène hétérologue. Les sites de multiclonage contiennent des séquences de reconnaissance pour Nhel, XhoI, Smal, BamHI et Ascl. Une pointe de flèche indique le site NotI pour la linéarisation des plasmides. Le schéma n'est pas à l'échelle.

Un schéma conceptuel qui résume l'intégration des vecteurs dans le génome. L'intégration de pCLys1 (a) et pCArg3 (b) dans le chromosome est montrée. Un astérisque indique le point de mutation de l'allèle lys1-K24. Une boîte avec des lignes diagonales indique un fragment de 262 pb inséré dans l'ORF de arg3. La longueur du squelette du vecteur n'est pas à l'échelle.

Nous avons également construit le vecteur pCArg3 pour l'intégration dans le locus arg3 via un processus similaire (Fig. 3b). Comme c'était le cas pour lys1, le fragment arg3 partiel cloné dans le vecteur pCArg3 devait être non fonctionnel, car l'extrémité du fragment cloné était toujours en amont des points de mutation dans les allèles obtenus par transformation arg3 sgRNA #1.

Nous avons ensuite examiné si les vecteurs nouvellement développés pouvaient être intégrés dans les locus cibles comme prévu (Fig. 4a, b). Si des souches ayant les allèles lysl-K24 ou arg3-R25 sont transformées avec pCLysl ou pCArg3, respectivement, des transformants prototrophes seront obtenus. Nous avons linéarisé ces plasmides avec NotI avant la transformation des cellules de levure. En tant que contrôle, nous avons introduit les plasmides directement dans les mutants auxotrophes pour examiner si la linéarisation est nécessaire ou non pour l'intégration.

Après l'introduction de plasmides ou de leurs fragments digérés dans des mutants auxotrophes, de grandes colonies sont apparues uniquement à partir des souches transformées avec des fragments digérés pour lys1-K24 et arg3-R25 (figure 5a). Bien que de minuscules colonies soient apparues à partir des souches transformées avec des plasmides non digérés, elles ne se sont pas agrandies. Pour voir si un gène donné pouvait être exprimé à l'aide des vecteurs développés dans cette étude, nous avons cloné un ORF codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) dans pCLys1 et pCArg3 en tant que représentant. Nous avons intégré ces plasmides dans le chromosome et récupéré certains transformants sans auxotrophie des acides aminés. Lorsque nous avons vérifié la fluorescence GFP après avoir strié les transformants sur une plaque EMM2, nous avons observé des signaux qui se dispersaient dans les cellules avec une légère accumulation dans le noyau, ce qui correspond à la localisation des protéines GFP libres dans la levure de fission (Fig. 5b)22. Pour confirmer que les fragments digérés ont été intégrés avec succès dans les locus cibles, nous avons examiné la structure du génome des transformants prototrophes par PCR sur colonie. Cette analyse a démontré que tous les fragments dérivés de pCLys1-GFP ou pCArg3-GFP étaient intégrés dans chaque locus cible comme prévu uniquement lorsque la fluorescence GFP était détectée (Fig. 5c).

Introduction de vecteurs nouvellement développés pour l'expression de gènes hétérologues. ( a ) Transformants apparus après l'introduction de plasmides linéarisés développés dans cette étude. Les souches AM595 (h – leu1-32 lys1-K24) et AM597 (h – leu1-32 arg3-R25) ont été transformées avec pCLys1 ou pCArg3 avec ou sans prétraitement NotI et étalées sur un milieu de sélection SD dépourvu de lysine et d'arginine. ( b ) Expression de GFP introduite à l'aide de pCLys1 et pCArg3. Les transformants qui ont émergé après l'introduction de pCLys1-GFP et pCArg3-GFP linéarisés dans les souches lys1-K24 ou arg3-R25 ont été détectés et la fluorescence GFP a été surveillée sous microscopie à fluorescence. (c) Confirmation de l'intégration chromosomique par PCR. L'intégration de pCLys1-GFP ou pCArg3-GFP dans le chromosome a été analysée par PCR en utilisant des amorces indiquées par des pointes de flèche. Les transformants #1 et #2 étaient des souches dans lesquelles une fluorescence GFP a été observée, alors que le transformant #3 n'avait pas de fluorescence. L'ADN lambda digéré avec EcoT14I a été utilisé comme marqueur de taille. (d) Expression simultanée de trois protéines dans une cellule. Les cellules transformées avec pCLys1, pCArg3 et pDUAL exprimant uvi15-CFP, gpi16-YFP et gar2-mCherry, respectivement, ont été observées sous microscopie à fluorescence. Les barres d'échelle indiquent 10 μm.

Enfin, nous avons examiné si 3 gènes pouvaient être exprimés simultanément en utilisant les vecteurs développés dans cette étude en combinaison avec le vecteur pDUAL précédemment développé. Pour détecter leur expression, nous avons utilisé trois protéines fluorescentes, CFP, YFP et mCherry. Nous avons identifié plusieurs protéines montrant une localisation subcellulaire claire à partir de nos archives de données de localisation15. Nous avons sélectionné la protéine nucléolaire Gar2, la protéine ER Gpi16 et Uvi15, qui se localise au niveau des extrémités et des septa cellulaires, et avons cloné leurs ORF en amont de CFP (pCLys1), YFP (pDUAL) et mCherry (pCArg3), respectivement. Ces gènes de fusion ont été exprimés sous le contrôle du promoteur nmt1. Nous avons intégré ces plasmides séquentiellement dans le chromosome d'une souche avec les allèles arg3-R25, lys1-K24 et leu1-32, et avons récupéré certains transformants ne présentant aucune auxotrophie des acides aminés. Nous avons également tenté de transformer des cellules avec les trois fragments de plasmide. Cependant, nous n'avons pu obtenir aucun transformant dans ces conditions. De plus, même lorsque deux des trois plasmides ont été utilisés, le nombre de transformants obtenus était presque négligeable. Lorsque nous avons vérifié la fluorescence après avoir cultivé des transformants sur une plaque EMM2 pour activer le promoteur nmt1, nous avons observé des signaux clairs de toutes les protéines de fusion (Fig. 5d). Comme prévu, Uvi15 a montré une localisation constante aux extrémités ou aux septa cellulaires, tandis que Gpi16 a été visualisé au niveau de structures membraneuses de type ER. Un signal fort de la protéine nucléolaire Gar2 a été observé dans un compartiment spécifique du noyau. Ainsi, nous avons démontré que l'introduction et l'expression de trois transgènes différents est possible en utilisant les vecteurs d'intégration nouvellement développés.

Nous avons développé deux ensembles de systèmes hôte-vecteur de levure de fission qui pourraient être utilisés pour l'expression hétérologue de gènes provenant des locus lys1 ou arg3. En utilisant ces vecteurs, nous avons démontré que les vecteurs développés étaient correctement intégrés dans les locus cibles, entraînant la génération de transformants prototrophes. De plus, nous avons démontré que la GFP clonée dans les vecteurs était exprimée comme prévu après l'intégration chromosomique. Ce type d'intégration conduit à la génération de séquences dupliquées de chaque côté du fragment intégré1, qui peuvent servir de régions d'homologie pour une recombinaison ultérieure conduisant à la délétion du fragment intégré, comme indiqué précédemment3. Pour surmonter ce problème, des vecteurs d'intégration qui ne produisent pas de régions génomiques répétitives en utilisant une double recombinaison croisée ont été développés3. Ces remplacements stables conviennent aux études à long terme, bien que cela se fasse au détriment d'une efficacité de transformation relativement faible. D'autre part, les vecteurs d'intégration à croisement unique présentent une efficacité de transformation élevée similaire à celle obtenue par l'introduction conventionnelle de plasmide, même en tenant compte d'un faible risque de produire une recombinaison supplémentaire. À partir de ces propriétés, les vecteurs de croisement simples peuvent convenir à des expériences qualitatives et quantitatives nécessitant une efficacité de transformation élevée, telles que le criblage à l'aide de bibliothèques de plasmides. Pratiquement, les transformants obtenus à partir des vecteurs développés dans cette étude ainsi que pDUAL peuvent être maintenus dans un milieu dépourvu d'acides aminés correspondants, exerçant ainsi facilement une pression sélective sur les transformants.

Une préoccupation majeure associée à l'utilisation du système CRISPR/Cas9 est la possibilité d'effets hors cible, qui impliquent l'introduction de mutations involontaires dans des emplacements génomiques autres que la cible prévue. Dans notre étude, nous avons rencontré plusieurs souches auxotrophes qui conservaient les gènes marqueurs de la cible, peut-être en raison d'effets hors cible. De plus, nous avons observé une incorporation inattendue d'un fragment d'ADN de saumon dans l'ORF arg3. L'intégration involontaire d'ADN exogène dans le génome de l'organisme hôte représente un problème potentiel supplémentaire lors de l'utilisation du système CRISPR/Cas9. Des études antérieures ont signalé l'insertion de fragments d'ADN de saumon dans le génome de la levure de fission20, et des occurrences similaires ont également été documentées dans d'autres organismes23, 24. Par conséquent, alors que CRISPR/Cas9 offre un potentiel substantiel pour l'édition du génome, il est impératif -effets ciblés et insertions involontaires. Bien que le processus d'obtention de l'allèle arg3-R25 était inattendu, l'insertion d'ADN exogène au niveau de la région 5' de l'ORF arg3 est d'un grand avantage pour ce système expérimental. En effet, l'insertion exerce une pression de sélection sur la région de recombinaison en aval du point inséré, ce qui est idéal pour obtenir des intégrants appropriés qui subissent une auxotrophie de l'arginine (Fig. 4b). Ainsi, nous avons sélectionné arg3-R25 comme l'allèle le plus approprié pour cibler arg3 à l'aide des vecteurs de la série pCArg3.

Dans la recherche sur les levures de fission, leu1+ et ura4+ ont été principalement utilisés comme marqueurs de sélection1. L'allèle leu1 de l'hôte le plus couramment utilisé est leu1-32, ayant une mutation faux-sens dans l'ORF4 leu1. D'autre part, le marqueur ura4 le plus couramment utilisé dans la souche hôte est la délétion complète ura4-D1818. Par conséquent, ura4-D18 ne peut pas être utilisé pour une recombinaison croisée simple. Bien que des vecteurs employant d'autres gènes marqueurs de sélection aient été progressivement développés, nous avons encore des options limitées pour l'intégration chromosomique d'un transgène. Les vecteurs développés dans cette étude serviront d'option précieuse pour l'expression de gènes hétérologues à partir du chromosome en combinaison avec la plupart des marqueurs précédemment rapportés. Dans ce contexte, ces vecteurs apporteront une contribution considérable aux expériences nécessitant l'expression de plusieurs transgènes.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires.

Réaction en chaîne par polymérase

Cadre de lecture ouvert

ARN monoguidé

Protéine fluorescente verte

Protéine fluorescente cyan

Protéine fluorescente jaune

Siam, R., Dolan, WP & Forsburg, SL Choix et utilisation des plasmides de Schizosaccharomyces pombe. Méthodes 33, 189–198 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ergün, BG, Hüccetoğulları, D., Öztürk, S., Çelik, E. & Çalık, P. Systèmes d'expression de levure établis et à venir. Méthodes Mol. biol. 1923, 1–74 (2019).

Article Google Scholar

Vještica, A. et al. Une boîte à outils de vecteurs d'intégration stables dans la levure de fission. J. Cell Sei. 133, jcs240754. https://doi.org/10.1242/jcs.240754 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Matsuyama, A. et al. pDUAL, un vecteur polyvalent et multicopie capable d'intégration chromosomique dans la levure de fission. Levure 21, 1289–1305 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Matsuyama, A., Shirai, A. & Yoshida, M. Une nouvelle série de vecteurs pour l'intégration chromosomique dans la levure de fission. Biochimie. Biophys. Rés. Commun. 374, 315–319 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jacobs, JZ, Ciccaglione, KM, Tournier, V. & Zaratiegui, M. Mise en œuvre du système CRISPR-Cas9 dans la levure de fission. Nat. Commun. 5, 5344 (2014).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Bhattacherjee, V. & Bhattacharjee, JK Séquence nucléotidique du gène lys1+ de Schizosaccharomyces pombe et similitudes de la protéine lys1+ avec les synthétases antibiotiques peptidiques. Levure 14, 479–484 (1998).

3.0.CO;2-T" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0061%2819980330%2914%3A5%3C479%3A%3AAID-YEA236%3E3.0.CO%3B2-T" aria-label="Article reference 7" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0061(19980330)14:53.0.CO;2-T">Article CAS PubMed Google Scholar

Van Huffel, C., Dubois, E. & Messenguy, F. Clonage et séquençage des gènes arg3 et arg11 de Schizosaccharomyces pombe sur un 10-kb. Fragment d'ADN Expression hétérologue et ciblage mitochondrial de leurs produits de traduction. EUR. J. Biochem. 205, 33–43 (1992).

Article PubMed Google Scholar

Gutz, H., Heslot, H., Leupold, U. & Loprieno, N. Schizosaccharomyces pombe. Dans Handbook of Genetics (éd. King, RC) 395–446 (Plenum Press, 1974).

Google Scholar

Maundrell, K. nmt1 de levure de fission. Un gène hautement transcrit complètement réprimé par la thiamine. J. Biol. Chim. 265, 10857–10864 (1990).

Article CAS PubMed Google Scholar

Matsuyama, A., Yabana, N., Watanabe, Y. & Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe Ste7p est nécessaire à la fois pour favoriser et empêcher l'entrée de la méiose. Génétique 155, 539–549 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, XR, He, JB, Wang, YZ & Du, LL Une méthode sans clonage pour l'édition du génome médiée par CRISPR/Cas9 dans la levure de fission. G3 8, 2067-2077 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodríguez-López, M. et al. Une méthode basée sur CRISPR/Cas9 et un outil de conception d'amorces pour l'édition transparente du génome dans la levure de fission. Bienvenue Open Res. 1, 19. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.10038.3 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Jacobus, AP & Gross, J. Clonage optimal de fragments PCR par recombinaison homologue dans Escherichia coli. PLoS ONE 10, e0119221. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119221 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Matsuyama, A. et al. Clonage ORFeome et analyse globale de la localisation des protéines chez la levure de fission Schizosaccharomyces pombe. Nat. Biotechnol. 24, 841–847 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kikuchi, Y., Kitazawa, Y., Shimatake, H. & Yamamoto, M. La structure primaire du gène leu1+ de Schizosaccharomyces pombe. Courant. Genet. 14, 375–379 (1988).

Article CAS PubMed Google Scholar

Szankasi, P., Heyer, WD, Schuchert, P. & Kohli, J. Analyse de la séquence d'ADN du gène ade6 de Schizosaccharomyces pombe : allèles de type sauvage et mutants, y compris l'allèle de tache hôte de recombinaison ade6-M26. J. Mol. Biol. 204, 917–925 (1988).

Article CAS PubMed Google Scholar

Grimm, C., Kohli, J., Murray, J. & Maundrell, K. Génie génétique de Schizosaccharomyces pombe : un système de perturbation et de remplacement des gènes utilisant le gène ura4 comme marqueur sélectionnable. Mol. Le général Genet. 215, 81–86 (1988).

Article CAS PubMed Google Scholar

Erickson, FL & Hannig, EM Caractérisation des ADNc de Schizosaccharomyces pombe his1 et his5. Levure 11, 157-167 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Longmuir, S., Akhtar, N. & MacNeill, SA Insertion inattendue de séquences d'ADN porteuses dans le génome de la levure de fission lors de la suppression du gène médiée par CRISPR-Cas9. BMC Rés. Notes 12, 191 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Keeney, JB & Boeke, JD Intégration ciblée efficace à leu1-32 et ura4-294 dans Schizosaccharomyces pombe. Génétique 136, 849–856 (1994).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Atkins, D. & Izant, JG Expression et analyse du gène de la protéine fluorescente verte dans la levure à fission Schizosaccharomyces pombe. Courant. Genet. 28, 585–588 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hunt, JMT, Samson, CA, Rand, AD & Sheppard, HM Résultats de l'édition CRISPR-Cas9 non intentionnels : un examen de la détection et de la prévalence des variantes structurelles générées par l'édition de gènes dans les cellules humaines. Hum. Genet. 142, 705–720 (2023).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Banakar, R. et al. Insertions d'ADN aléatoires à haute fréquence lors de la co-administration de la ribonucléoprotéine CRISPR-Cas9 et du plasmide marqueur sélectionnable dans le riz. Sci. Rep. 9, 19902 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Ce travail a été soutenu en partie par JSPS KAKENHI Grant Numbers 15K14925 et 22K05361.

Groupe de recherche en génomique chimique, RIKEN Center for Sustainable Resource Science, 2-1, Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japon

Akihisa Matsuyama, Atsushi Hashimoto et Minoru Yoshida

Laboratoire de microbiologie, Département de biotechnologie, École supérieure des sciences agricoles et de la vie, Université de Tokyo, Tokyo, 113-8657, Japon

Akihisa Matsuyama, Shinichi Nishimura et Minoru Yoshida

Institut de recherche collaborative pour la microbiologie innovante, Université de Tokyo, Tokyo, 113-8657, Japon

Shinichi Nishimura et Minoru Yoshida

École supérieure des sciences intégrées pour la vie, Université d'Hiroshima, Higashi-Hiroshima, 739-8528, Japon

Shinichi Nishimura

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Ce travail a été conceptualisé par AM et MY Toutes les expériences ont été faites par AM et AHAM a préparé le projet original. SN et MY ont édité le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Akihisa Matsuyama.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Matsuyama, A., Hashimoto, A., Nishimura, S. et al. Un ensemble de vecteurs et de souches pour l'intégration chromosomique dans la levure de fission. Sci Rep 13, 9295 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36267-1

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Reçu : 03 février 2023

Accepté : 31 mai 2023

Publié: 08 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36267-1

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